miR-181a通过调控Smad7对COPD大鼠气道重塑的作用研究

王雅杰，王 嘉，岳洪娟，窦亚平，李 娜

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常见的慢性呼吸系统疾病，发病率高、致死率高，严重威胁人类健康。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子非编码单链RNA，其异常表达与多种疾病密切相关。研究发现COPD患者肺组织多种miRNA上调，可能影响缺氧诱导因子-1α相关的肺结构修复程序，与COPD发病机制有关。母亲信号蛋白同源物(mothers against decapentaplegic homolog，Smad)蛋白家族是转化生长因子β家族(transforming growth factor-βs，TGF-βs)的重要底物，分为受体激活型、通用型和抑制型三种，Smad7是抑制型Smad，可以选择性抑制TGF-βs信号通路。研究发现COPD患者肺组织Smad7表达下调，且与气道壁厚度、气道平滑肌厚度呈负相关。miR-181a在COPD中是否通过调控Smad7发挥作用，尚不清楚，该研究通过建立COPD大鼠模型，探讨miR-181a是否通过调控Smad7对COPD大鼠气道重塑发挥作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

实验动物 清洁级SD雄性大鼠80只，8周龄，体质量200～250 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。大鼠购入后于清洁通风环境中适应性饲养7 d，温度20～26 ℃，湿度40%～60%，明暗周期12 h/12 h循环。

1.1.2

主要试剂与仪器 miR-181a mimics、miR-181a inhibitors、control mimics(广州市锐博生物科技有限公司)，脂多糖(北京索莱宝公司，批号：224R032)，大前门牌香烟(上海烟草公司)，兔抗大鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metallo proteinase，MMP-9)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)单克隆抗体、兔抗大鼠Smad7、p-Smad7多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(美国Abcam公司)，ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，SA-ALC-V8S小动物呼吸机(北京中西华大科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1

建模与分组 80只大鼠随机取65只参考黄文锋 等的方法建立COPD大鼠模型，分别于第1、15 天气管内注入200 μl脂多糖溶液(1 g/L)，并且于第2～28天(除第15天)将大鼠置于留有两个通气孔的72 L玻璃箱中被动吸烟，每次30 min，每天2次，间隔8 h，每天12支烟。4周后，所有大鼠腹腔注射30 mg/kg的3%戊巴比妥钠麻醉后，固定头部及四肢，正中切开气管、插管，然后将大鼠仰卧于小动物呼吸机支撑板上，气管插管与体描箱气路相连，气道压力曲线显示正常后，关闭体描箱，测量气体压力变化，间接获取肺容积变化，计算机处理后得到肺功能指标，计算第一秒用力呼气量(forced expiratory volume，FEV)占用力肺活量(forced vital capacity，FVC)的比值，FEV/FVC<70%即为建模成功。将建模成功的56只大鼠随机分为模型组、mimics组、inhibitors组、NC组，各14只，剩余15只大鼠为假手术组。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.2.2

干预方法 建模2 h后进行干预，mimics组尾静脉注射miR-181a mimics，inhibitors组尾静脉注射miR-181a inhibitors，NC组尾静脉注射control mimics，注射速度1 μl/min，共注射10 μl。假手术组、模型组尾静脉注射10 μl生理盐水。

1.2.3

组织取材 干预24 h后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，腹主动脉穿刺放血后处死，开胸暴露双肺，分离左肺和右肺组织。各组取7只大鼠右肺组织，10%甲醛固定液内清洗并浸泡30 min，放进40%甲醛溶液中固定备用。其余右肺剪取前叶、中叶及后叶，用无菌纱布蘸去表面的血迹，加入生理盐水用匀浆器制备肺组织匀浆，3 000 r/min，离心半径8 cm，离心15 min，留取上清液-20 ℃保存。所有左肺剔除肺外组织，液氮速冻后-80 ℃保存。

1.2.4

RT-qPCR检测肺组织miR-181a、Smad7 mRNA相对表达水平 取-80 ℃保存的左肺组织100 mg，冰上研磨，TRIzol法提取总RNA，检测RNA的浓度和纯度，按照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA，进行荧光定量PCR，反应体系包括模板cDNA 2 μl，上下游引物各1.5 μl，Taq DNA聚合酶7.5 μl，加双蒸水至总体积15 μl。反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共45个循环，分别以U6和GDPAH为内参基因，依据2法计算目的基因的相对表达量。引物由擎科生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5

各组肺组织匀浆IL-1β、TNF-α水平检测 取-20 ℃保存的肺组织匀浆上清液，按照ELISA试剂盒说明书加样，用全自动酶标仪测定450 nm处的吸光值，通过绘制标准曲线得出IL-1β和TNF-α的浓度。

1.2.6

荧光素酶报告系统检测miR-181a对Smad7的靶向性 首先使用靶基因预测数据库TargetScan,miRanda和PicTar预测miRNA-181a的靶基因，结合文献研究、基因序列及功能挑选预测值较高的靶点(即Smad7)进行验证。构建野生型及突变型Smad7基因3′-UTR-荧光素酶表达载体，接种支气管上皮细胞于24孔板中，待细胞培养至融合度约为60%，用Lipofectamine 2000将野生型或突变型质粒分别与miRNA-181a mimics(miRNA-181a mimics组)和miR-181a inhibitors(miR-181a inhibitors组)共转染到细胞内，常规培养48 h，细胞裂解液裂解后，4 ℃，3 600 r/min离心10 min收集上清液，检测相对荧光素酶活性。

1.2.7

HE染色观察大鼠肺组织病理学变化 取10%甲醛溶液中固定的右肺组织，在最大横径处切2 mm厚的组织块，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，做苏木精-伊红(HE)染色，封片，置于显微镜下拍照，用图像分析软件测量支气管壁厚度及支气管壁胶原纤维厚度。

1.2.8

Western blot检测肺组织TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9蛋白相对表达水平 取-80 ℃保存的左肺组织100 mg，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，离心取上清液用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，100 ℃水浴使蛋白变性，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h，洗膜，加入1 ∶1 000稀释的TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入1 ∶4 000辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，洗膜后加入ECL发光液显影，采用Image J软件分析图像，以β-actin为内参，TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9相对表达量以各蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值表示。

2 结果

2.1 各组肺组织miR-181a、Smad7 mRNA相对表达水平

肺组织miR-181a mRNA相对表达水平组间比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)。与假手术组比较，模型组、NC组和inhibitors组miR-181a mRNA相对表达水平降低，mimics组miR-181a mRNA相对表达水平升高(

P

<0.05)；与模型组和NC组比较，mimics组miR-181a mRNA相对表达水平升高，inhibitors组miR-181a mRNA相对表达水平降低(

P

<0.05)；与mimics组比较，inhibitors组miR-181a mRNA相对表达水平降低(

P

<0.05)；模型组和NC组miR-181a mRNA相对表达水平比较，差异无统计学意义(

P

>0.05)。肺组织Smad7 mRNA相对表达水平组间比较，差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表2。

表2 肺组织miR-181a、Smad7 mRNA相对表达水平

2.2 各组肺组织匀浆IL-1β、TNF-α水平比较

肺组织匀浆IL-1β、TNF-α水平组间比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)。与假手术组比较，模型组、NC组、mimics组、inhibitors组肺组织匀浆IL-1β、TNF-α水平升高(

P

<0.05)；与模型组和NC组比较，mimics组肺组织匀浆IL-1β、TNF-α水平降低，inhibitors组肺组织匀浆IL-1β、TNF-α水平升高(

P

<0.05)；与mimics组比较，inhibitors组肺组织匀浆IL-1β、TNF-α水平升高(

P

<0.05)；模型组和NC组肺组织匀浆IL-1β、TNF-α水平比较，差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表3。

表3 各组肺组织匀浆IL- 1β、TNF-α水平

2.3 miR-181a潜在的靶基因预测

TargetScan在线预测发现，Smad7 3′-UTR上存在miR-181a的结合位点。见图1。

图1 Smad7 3′-UTR与miR-181a的互补序列

采用双荧光素酶报告基因实验进一步验证结果发现，与Smad7 3′-UTR野生型质粒共转染时，miR-181a mimics组荧光素酶活性明显低于miR-181a inhibitors组(

P

<0.05)；与Smad7 3′-UTR突变型质粒共转染时，miR-181a mimics组和miR-181a inhibitors组荧光素酶活性比较，差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表4。

表4 支气管上皮细胞相对荧光素酶活性比较

2.4 各组大鼠肺组织病理学变化

假手术组大鼠肺泡细胞正常，呈空泡状，薄壁结构，小支气管无腺体及炎性细胞浸润，无纤维组织增生；模型组、NC组大鼠肺实质破坏，肺泡明显扩张，相邻肺泡融合成较大囊腔，气道管增厚并可见炎性细胞浸润，大量胶原纤维形成。mimics组肺泡细胞趋于正常，炎症明显减轻，胶原纤维明显减少，肺泡结构紊乱明显好转。inhibitors组肺组织病理学变化与模型组和NC组相似。见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理学变化 HE×400A：假手术组；B：模型组；C：NC组；D：mimics组；E：inhibitors组

2.5 各组大鼠支气管壁厚度和支气管壁胶原纤维厚度

支气管壁厚度和支气管壁胶原纤维厚度组间比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)。与假手术组比较，模型组、NC组、mimics组、inhibitors组支气管壁和支气管壁胶原纤维加厚(

P

<0.05)；与模型组和NC组比较，mimics组支气管壁和支气管壁胶原纤维变薄，inhibitors组加厚(

P

<0.05)；与mimics组比较，inhibitors组支气管壁和支气管壁胶原纤维加厚(

P

<0.05)；模型组和NC组支气管壁厚度和支气管壁胶原纤维厚度比较，差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表5。

表5 各组大鼠支气管壁厚度和支气管壁胶原纤维厚度

2.6 肺组织TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9蛋白相对表达水平比较

肺组织TGF-β1、p-Smad7、MMP-9蛋白相对表达水平组间比较，差异有统计学意义(

P

<0.05)。与假手术组比较，模型组、NC组、mimics组和inhibitors组肺组织TGF-β1、MMP-9蛋白相对表达水平升高，p-Smad7蛋白相对表达水平降低(

P

<0.05)；与模型组和NC组比较，mimics组肺组织TGF-β1、MMP-9蛋白相对表达水平降低，p-Smad7蛋白相对表达水平升高，inhibitors组肺组织TGF-β1、MMP-9蛋白相对表达水平升高，p-Smad7蛋白相对表达水平降低(

P

<0.05)；与mimics组比较，inhibitors组肺组织TGF-β1、MMP-9蛋白相对表达水平升高，p-Smad7蛋白相对表达水平降低(

P

<0.05)；模型组和NC组肺组织TGF-β1、p-Smad7、MMP-9蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义(

P

>0.05)。肺组织Smad7蛋白相对表达水平组间比较，差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表6，图3。

表6 肺组织TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9蛋白相对表达水平

图3 肺组织TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9蛋白相对表达水平

3 讨论

COPD是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎或肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭等常见慢性疾病，其发病与有害气体及有害颗粒引起的炎症反应有关。miRNA通过与其靶向的mRNA碱基互补配对，参与基因转录后表达调控，诱导mRNA降解或抑制其翻译，在生物生长分化、细胞凋亡、炎症反应中发挥重要作用。研究发现miRNA可参与多种肺部疾病的发病过程，如肺结核、肺癌、COPD、哮喘和特发性肺间质纤维化等。通过检测COPD患者组和健康组肺组织中miRNAs的表达情况，发现COPD患者肺组织中有多种miRNAs异常表达。COPD目前尚缺少有效灵敏的分子标记物，miRNA通过调节靶基因的表达，参与多种肺部疾病的发病过程，可以作为早期治疗的潜在分子标记物。

miR-181是关键的基因表达调控因子，参与生物体免疫、炎症反应，细胞周期调控、凋亡等过程。最近研究发现，miR-181a能够参与肺部炎症性疾病的发生发展，参与肺上皮细胞损伤及炎症因子形成过程。Du et al发现在急性肺损伤模型中，miR-181a可以通过下调靶基因Toll样受体4，负调控THP-1巨噬细胞炎症因子分泌，与气道炎症性疾病有关。李翠娟 等研究发现 COPD患者血清miR-181a与炎性因子变化密切相关。本研究中mimics组miR-181a mRNA相对表达水平高于其他组，HE染色显示其肺泡细胞趋于正常、炎症明显减轻、胶原纤维明显减少、肺泡结构紊乱明显好转，支气管壁厚度和支气管壁胶原纤维厚度较高，且肺组织中IL-1β、TNF-α水平显著降低，而inhibitors组上述指标与mimics组相反，提示miR-181a可降低COPD模型大鼠炎症反应，对气道重塑、肺组织病理形态有改善作用。

Smad7作为抑制性Smad，能够被TGF-β诱导，反过来抑制TGF-β，是TGF-β信号通路负调节剂，Smad7与R-Smad2/3竞争性结合跨膜Ⅰ型丝/苏氨酸激酶受体抑制受体激活型Smad磷酸化，从而抑制COPD的发生与发展。TGF-β是生长因子家族，哺乳动物中有3种亚型，即TGF-β1～3，肺组织中含量最高且具有生物活性的是TGF-β1。MMP-9与COPD发病密切相关，参与肺组织的损害和重构、促进气道杯状细胞增生和黏液表达。张喆 等研究发现，COPD模型组小鼠肺泡灌洗液中MMP-2、MMP-9、TGF-β1水平显著上升，说明该时期模型组小鼠发生气道重塑。梁珍珍 等研究发现miR-181a过表达可以缓解IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的生成及IV型胶原蛋白、纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达，从而在COPD气道重塑中发挥拮抗作用。模型组MMP-9和TGF-β1表达上调，p-Smad7表达下调，inhibitors组加重了这一现象，而mimics组与模型组和inhibitors组结果相反。本研究中荧光素酶报告基因实验结果提示：miR-181a通过调控Smad7发挥作用。以上研究结果提示miR-181a过表达通过促进p-Smad7的表达，抑制MMP-9和TGF-β1表达，改善气道重塑。

综上所述，miR-181a对COPD模型大鼠肺组织中气道重塑有改善作用，可能通过靶向调控Smad7的表达发挥作用，为临床治疗COPD提供一定理论依据。