不同保存条件下罗非鱼样品中磺胺嘧啶的降解规律研究

周玲 李秋月 雷从改 符芳霞 李云 程斌 覃锐 刘天密

摘要 选择经常检出的磺胺嘧啶作为研究对象，通过测定不同保存条件下罗非鱼中不同浓度磺胺嘧啶的稳定性，确定罗非鱼磺胺类药物监测中的样品保存条件和运输温度条件。结果表明，样品中不同浓度的磺胺嘧啶均有不同程度的降解，但因保存条件的不同，降解速率各不相同。在常温条件下保存，罗非鱼样品中磺胺嘧啶的浓度越高，降解速度越慢;在冷藏条件下保存，罗非鱼样品中磺胺嘧啶浓度越高，也呈降解速度越慢的趋势;在冷冻条件下保存，罗非鱼样品中磺胺嘧啶的降解速度没有明显的变化。罗非鱼样品中不同浓度的磺胺嘧啶在3种保存条件下（常温25～28 ℃，冷藏0～4 ℃，冷冻-18～-22 ℃）的降解速率为常温>冷藏>冷冻。因此，用于磺胺嘧啶检测的罗非鱼样品应贮存于冷冻条件下，并尽快分析。

关键词 罗非鱼样品;磺胺嘧啶;降解规律

中图分类号 S 948  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）16-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.047   开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Degradation of Sulfadiazine under Different Storage Conditions in Tilapia Fish Muscle Samples

ZHOU Ling，LI Qiu-yue，LEI Cong-gai et al

（Testing Center for Aquatic Products Quality and Safety of Hainan Province，Haikou， Hainan 570206）

Abstract The frequently detected sulfadiazine was selected as the research object. To ensure the transportation temperature and storage conditions of tilapia fish muscle samples for monitoring of sulfonamides by detecting the stability of different concentrations of sulfadiazine in tilapia fish muscle samsulfonamidesples under different storage conditions. The results showed that sulfadiazine of different concentrations in tilapia fish muscle samples degraded with various degrees， however， the degradation rate varied due to different storage conditions. The degradation rate of sulfadiazine in tilapia fish muscle samples were both slower with the increase of sulfadiazine concentration at room temperature and cold storage. But there was no significant change in the degradation rate of sulfadiazine in tilapia fish muscle samples stored under freezing condition. The result also showed that the degradation rate of sulfadiazine at different concentrations in tilapia fish muscle samples under three storage conditions were in order of room temperature condition > refrigerated condition > freezing condition. Therefore， tilapia fish muscle samples for sulfadiazine detection should be stored under freezing conditions and analyzed as soon as possible.

Key words Tilapia fish muscle samples;Sulfadiazine;Degradation law

磺胺類药物为人工合成的抗菌药，它具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便等优点，在水产养殖中广泛使用[1]。但是，如果磺胺类药物使用不当或使用时未遵守其休药期，可造成药物在动物组织中的残留[2-3]。残留的药物不仅会对人的健康造成潜在危害，引起过敏反应、肾脏损坏、白细胞减少症等，还是水产品出口贸易中的主要障碍[4]。2015年美国FDA发布拒绝进口产品通报，其中我国广西、海南等地多批罗非鱼因兽残问题被拒绝入境。因为磺胺问题，给我国的罗非鱼养殖业带来了严重影响，造成养殖企业和养殖户的巨大经济损失。

美国、欧盟、日本等已禁止磺胺类药物用于水产养殖业。罗非鱼磺胺类药物残留监测迫在眉睫。以往的研究多集中于活体动物药代动力学和检测方法方面[5-10]，而不同保存条件对罗非鱼中磺胺类药物检测结果的影响鲜见报道。该研究选择经常检出的磺胺嘧啶作为研究对象，拟通过测定不同保存条件下罗非鱼中不同浓度磺胺嘧啶的稳定性，以确定罗非鱼磺胺类药物监测中样品的保存条件和运输温度条件。

1 材料与方法

1.1 试验对象和药物

通过走访、调查和2015—2017年的专项抽检发现，磺胺类药物中磺胺嘧啶最易超标。由于磺胺嘧啶是限用药，选用上市规格的罗非鱼作为研究对象，罗非鱼500 g/尾左右。试验罗非鱼购自海南振宇实业有限公司，并租用该公司7个养殖网箱进行养殖试验，设有增氧设备。每个养殖网箱投放20尾罗非鱼，试验罗非鱼暂养10 d后开始投喂拌药饲料。

试验用磺胺嘧啶为标准试剂（≥98.0%），采用拌料投喂的方式进行给药。

1.2 试验设计

设置4、8、12 mg/kg 3个不同给药浓度，每个浓度2个平行，6个试验组，1个空白对照组（CK），共7个组。除了药物浓度不同，其他养殖条件保持一致。给药前7 d在实验室将不同药物浓度的饲料拌好晾干分装并存放于冰柜中。6月19日开始分别在6个试验网箱中投喂相应浓度的拌药饲料。给药7 d后，随机抽取10尾罗非鱼，取其肌肉制成肉糜在不同条件下保存[常温（25～28 ℃）、冷藏（0～4 ℃）和冷冻（-18～-22 ℃）]。

常温保存下易变质，样品于保存的第0、1、2、3、6天取出，检测其磺胺嘧啶含量，冷藏样品于保存的第0、1、2、3、6、10、20天取出，冷冻样品于保存的第0、1、2、3、6、10、20、30、41天取出，在常温下解冻后检测磺胺嘧啶含量。

7个养殖网箱中剩下的罗非鱼继续养殖22 d后（按500度日的休药期进行计算，池温25～28 ℃），捕获带回实验室，分别去磷、去皮，取其肌肉均质制成肉糜，检测其磺胺嘧啶的含量。

1.3 样品处理

喂药后7 d，分别捕获7个养殖网箱的罗非鱼，带回实验室去磷、去皮，取其肌肉均质制成肉糜。按试验设计要求，每组罗非鱼肉糜平均分成21份（常温5份，冷藏7份，冷冻9份），分别保存于不同环境条件下。

1.4 主要仪器与试剂

试验仪器：AB SCIEX Triple QuadTM 4500三重四级杆液质联用仪，涡旋混合器（英国Stuart SA8），超声波清洗仪（德国Elma S 300H），低速冷凍离心机（上海安亭DL-6000B），旋转蒸发仪（英国Stuart RE300DB）。

试验用水为Milli-Q制备高纯水;甲醇、乙腈均为色谱纯，购自Merk公司;甲酸为色谱纯，购自上海科密欧公司;乙酸铵为色谱纯，购自阿拉丁公司;磺胺嘧啶标准品，购自北京坛墨公司;磺胺邻二甲氧嘧啶-D3标准品，购自农业部农产品质量标准研究中心。

1.5 样品检测

试验方法参照《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 农业部1077号公告-1-2008》《动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法 GB/T 21316—2007》及相关文献进行。0 d的回收率99%，2 d的回收率83%。

2 结果与分析

2.1 罗非鱼样品保存0 d磺胺嘧啶检测结果对比

该试验采取低、中、高3种浓度磺胺嘧啶拌料投喂各试验组罗非鱼，以获得自然的带有磺胺嘧啶的罗非鱼样品。由表1可知，除了6# 网箱外，各试验网箱中罗非鱼磺胺残留量的测定值与投喂浓度之间呈正相关，这可能与6#网箱中罗非鱼的进食量不佳有关。各测定值之间存在显著差异（ P <0.05），即使是相同的投喂浓度，4、8和12 mg/kg组间也存在显著差异，这可能是由于自然投喂给药条件下罗非鱼的进食量不同所致。试验组间各测定值的变异系数最小为0.04，最大为0.13，平均值为0.08，这说明在对罗非鱼样品进行制样处理时，搅拌相对比较均匀。而CK的测定值之间差异大，有可能是检测误差造成。

2.2 罗非鱼样品中磺胺嘧啶在常温状态下的降解规律

在常温下，罗非鱼样品放置2 d开始产生异味，放置6 d后，已经完全腐败，分别检测保存0、1、2、3、6 d后其磺胺嘧啶含量，检测结果见表2。由表2可知，在常温条件下保存，各试验组罗非鱼样品中磺胺嘧啶含量基本都随保存时间的延长呈现不断下降的趋势。6 d后，1#罗非鱼磺胺嘧啶降解了100%，2#  降解了86.13%，3# 降解了43.20%，4# 降解了53.87%，5# 降解了34.01%，6# 降解了7540%。这说明在常温条件下保存，罗非鱼中的磺胺嘧啶较易降解。

2.3 罗非鱼样品中磺胺嘧啶在冷藏状态下的降解规律

冷藏条件下保存的罗非鱼样品在保存10 d时出现异味，20 d已经腐败。分别检测其保存0、1、2、3、6、10、20 d后磺胺嘧啶含量，检测结果见表3。由表3可知，在冷藏条件下保存，各试验组罗非鱼中磺胺嘧啶含量均随保存时间的延长呈不断下降的趋势。保存6 d后，1#罗非鱼磺胺嘧啶降解了1819%，远小于常温组的100%;2# 降解了1443%，远小于常温组的86.13%;3# 降解了12.68%，远小于常温组的43.20%;4# 降解了14.95%，远小于常温组的53.87%;5# 降解了4.36%，远小于常温组的34.01%;6# 降解了18.94%，远小于常温组的75.40%。20 d后，1# 罗非鱼磺胺嘧啶降解了19.56%，2# 降解了17.95%，3# 降解了22.87%，4# 降解了1698%，5# 降解了11.11%，6# 降解了30.88%，均低于常温下保存6 d的降解百分比。这说明相较于常温条件下保存，罗非鱼样品中的磺胺嘧啶在冷藏条件下保存的降解速度要慢得多。

2.4 罗非鱼样品中磺胺嘧啶在冷冻状态下的降解规律

在冷冻条件下保存41 d，罗非鱼样品未出现异味，分别检测其保存0、1、2、3、6、10、20、30、41 d后磺胺嘧啶的含量，检测结果见表4。由表4可知，在冷冻条件下保存6 d后，1#、2#、3#、4#、5#和6#组罗非鱼样品中磺胺嘧啶的降解百分比分别为11.01%、16.88%、10.60%、5.86%、5.79%和6.79%，远小于常温下保存6 d各组的降解百分比，1#、3#、4#和6# 组小于冷藏保存6 d各组的降解百分比，2#和5#组无明显差异;在冷冻条件下保存10 d后，1#、2#、3#、4#、5#和6# 组罗非鱼样品中磺胺嘧啶的降解百分比分别为5.12%、8.97%、4.13%、946%、6.93%和4.54%，出现了不降反升的现象。在冷冻条件下保存20 d后，各组罗非鱼样品中磺胺嘧啶的降解百分比分别为16.75%、20.48%、17.43%、2035%、18.26%和25.61%，与冷藏保存20 d各组的降解百分比没有明显差异;在冷冻条件下保存41 d，各组罗非鱼样品的磺胺嘧啶含量均呈下降趋势。

2.5 休药后的检测结果

7个养殖网箱中剩下的罗非鱼继续养殖22 d（过休药期）后，由于部分罗非鱼死亡，只有1#、2#、3#、4#和6# 网箱中还有罗非鱼存活，分别取其肌肉制成肉糜，经检测，1#、2#、3#、4#和6# 网箱罗非鱼样品磺胺嘧啶的测定值分别为14.31、19.58、10.35、26.52和11.24 μg/kg，远小于国定规定的限量值100 μg/kg。这说明在罗非鱼养殖过程中使用磺胺嘧啶后，只要严格执行休药期的规定，磺胺嘧啶含量基本均能降解到安全范围内。

3 讨论

3.1 该试验的创新与不足

与以往采用加标获得试验用阳性样品的方式不同，该试验采用与养殖生产实际一致的拌料投喂的给药方式。虽然低浓度、中浓度和高浓度组间罗非鱼样品中最终磺胺嘧啶含量的平行性不佳，但也获得了具有显著差异（ P <0.05）的梯度磺胺嘧啶罗非鱼样品。通过拌料投喂的给药方式，保持了与养殖生产实际的一致性和阳性样品的真实性，研究结果更利于实际的检测应用。该试验不足之处有3点：不同给药浓度组间平行不够，至少设置3个平行，而该试验只设置了2个平行;每次检测至少进3针，求3次检测结果的平均值，而该试验检测时只进1针，检测结果的代表性不足;冷冻样品的解冻时间未严格保持一致，导致冷冻保存10 d的检测结果出现异常。在今后试验研究中要做好前期准备和试验设计，减少此类因素对试验结果造成的影响。

3.2 样品中药物浓度对降解速率的影响

常温条件下，保存6天后各试验组罗非鱼样品中磺胺嘧啶的降解速度为1#（100%）>2#（86.13%）>6#（75.4%）>4#（53.87%）>3#（43.2%）>5#（34.01%），浓度越高降解速度越慢;冷藏条件下，保存20 d后各试验组罗非鱼样品中磺胺嘧啶的降解速度为6#（30.88%）>3#（22.87%）>1#（19.56%）>2#（17.95%）>4#（16.98%）>5#（11.11%），基本也呈浓度越高降解速度越慢的趋势。冷冻条件下，保存41 d后各试验组罗非鱼样品中磺胺嘧啶的降解速度为4#（52.20%）>6#（43.64%）>2#（36.21）>3#（32.49%）>5#（32.13%）>1#（30.07%），没有明显的变化趋势。

3.3 样品保存条件对检测结果的影响

为了保证样品中待测成分的稳定性，样品必须储藏在一定的温度条件下，对保存时间也有严格的要求。李长皓等[11]研究表明，不同保存条件会影响生鲜乳质量安全指标的检测结果，样品冷藏时间在48 h以内、冷冻时间在30 d以内，均对样品中黄曲霉毒素、铅、汞、砷、铬、三聚氰胺的检测结果无影响。

当保存条件和保存时间不当时，就会影响样品中成分的稳定性。该试验的研究结果表明，罗非鱼样品中不同浓度的磺胺嘧啶在3种保存条件下（常温25～28 ℃，冷藏0～4 ℃，冷冻-18～-22 ℃）的降解速率为常温>冷藏>冷冻。黄向荣等[12]研究结果表明，不同浓度的孔雀石绿和隐性孔雀石绿在3种贮藏条件下（室温20～25 ℃，冷藏0～4 ℃和冷冻-18 ℃）均有不同程度的降解，但因贮藏条件的不同，降解速率各不相同，降解速率为常温>冷藏>冷冻。如果样品能尽快进行检测，即可在常温和冷藏条件下进行短期保存;如样品不能尽快安排检测，则须冷冻保存，但冷冻保存时间也不易过长。赵慧星等[13]研究了蔬菜中残留农药在不同温度条件下的降解速率，结果表明，常温条件下各农药的降解速率较快，低温冷藏条件下，各农药降解速度均有所下降，但不同农药在同一温度条件下的降解速率也不相同。有些药残样品需在冷藏和冷冻条件下保存，但另一些药残样品则需在常温和冷冻条件下保存。不同贮藏条件下加标样品中的五氯酚钠均有所降解，降解速率表现为冷藏条件> 常温条件>冷冻条件[14]。五氯酚钠加标样品可以在常温下进行短时间保存，便于尽快进行检测;但如样品不能尽快安排检测（超过24 h），则需用冷冻保存，以保存样品的原有属性，避免影响检测结果。

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