载脂蛋白E等位基因多态性对徐州地区高血压患者的影响

李 磊,孔倩倩,钮 威，王 丽，牛璐璐,余汉忠△

1.江苏省徐州市第三人民医院检验科,江苏徐州 221000；2.中国矿业大学/江苏省徐州市第一人民医院检验科,江苏徐州 221009

高血压是引起各种心脑血管意外的最主要危险因素[1]。现阶段我国迫切需要改善人们对高血压的认知，提升全民对高血压的防治意识[2]。应根据血压测量值和不同危险因素的评估来制订高血压治疗方案。医生根据患者的具体情况判断患者最适合维持的血压水平，采取针对性的预防和治疗措施，从而降低心脑血管事件的发生概率[3]。

载脂蛋白E(ApoE)是一种由单链多肽聚合而形成的糖蛋白，它含有299个氨基酸，基因定位于人类19 号染色体的长臂上(13q13.2)。ApoE的3种主要异构体E2、E3、E4分别由3 种共显性等位基因ε2、ε3、ε4所编码。3种异构体间的单个氨基酸替换及它们与4种受体亲和程度的差异，决定了ApoE结构基因的遗传多态性[4]。人群中3种等位基因的表达方式不同，可以形成6种不同的ApoE表型：3种纯合子E2/2、E3/3、E4/4，3种杂合子E2/3、E2/4、E3/4，它们对应的基因型分别为ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4。ApoE基因多态性与血脂代谢异常密切相关，近年来，关于ApoE基因多态性与糖尿病肾病、脑梗死、阿尔茨海默病等多种疾病之间的关系被广泛报道[5-7]。但对于ApoE基因多态性能否影响高血压患者的血压水平，以及ApoE等位基因频率在高血压人群中的分布尚不十分清楚。本研究选取徐州地区临床收治的确诊高血压患者为研究对象，了解ApoE等位基因在高血压人群中的分布情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取徐州市第一人民医院2017年1月至2018年1月收治的临床确诊高血压患者97例作为高血压组，选取同期非高血压住院患者106例作为对照组。高血压组:男性58例，女性39例；平均年龄(58.61±12.15)岁；对照组：男性66例，女性40例；平均年龄(54.29±11.92)岁。2组患者年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)。高血压诊断标准：所有入组患者均符合1978年WHO建议的高血压诊断标准[8]，即收缩压≥160 mm Hg和(或)舒张压≥90 mm Hg。排除冠心病，糖尿病，脑、肝、肾疾病，血脂异常及服用降压药物的患者。等位基因频率计算方法：ε2、ε3、ε4 3种等位基因出现的频次分别与这3种等位基因在每组中出现的总频次的百分比。

1.2仪器与试剂 全血基因DNA提取试剂盒(离心柱型，产品批号Q5906)购自根生化科技(北京)有限公司，人类ApoE和SLCO1B1基因检测试剂盒(产品批号17111506)购自武汉友芝友生物科技有限公司。无水乙醇、杭州博日全自动荧光检测PCR扩增仪、各种加样器、加样吸头等。

1.3方法

1.3.1全血基因DNA提取 (1)采集患者乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝静脉全血2 mL，充分混匀后吸取200 μL全血加入1.5 mL EP离心管中，再加入20 μL 蛋白酶K溶液。(2)在上述试管中加入200 μL GB缓冲液，充分混匀，置56 ℃ 10 min，其间颠倒混匀数次。(3)试管中再加入200 μL无水乙醇，充分混匀。(4)将上一步所得混合溶液全部转移到吸附柱CB3中(吸附柱提前放入收集管中)，12 000 r/min离心30 s，弃去收集管中的废液。(5)向上述吸附柱CB3中再加入500 μL GD缓冲液，12 000 r/min离心30 s，弃去收集管中的废液。(6)再向吸附柱CB3中加入600 μL 的PW缓冲液，12 000 r/min离心30 s，弃去收集管中的废液。(7)重复第6步操作。(8)12 000 r/min离心2 min后将吸附柱CB3置室温开盖放置5 min，使乙醇充分挥发。(9)将处理后的吸附柱CB3转入一个新的1.5 mL离心管中，将100 μL TB洗脱缓冲液悬空滴加于吸附膜中间位置，于室温放置4 min，12 000 r/min离心2 min，收集离心后的液体，-80 ℃冻存备用。

1.3.2APOE基因型检测 (1)取出人类ApoE和SLCO1B1基因检测试剂盒，室温平衡解冻30 min，每个反应管中分别加入23 μL E2和E4反应液。(2)将提取后的待测样本基因组DNA、弱阳性对照和空白对照各2 μL分别加入上述反应管中。(3)盖紧PCR反应管盖，于杭州博日全自动荧光检测PCR扩增仪上检测。(4)杭州博日全自动荧光检测PCR扩增仪APOE2 526C-FAM通道、APOE2 526T-VIC通道、APOE4 388T-FAM通道、APOE4 388C-FAM通道、内标基因-ROX通道分别采集荧光信号。(5)PCR反应条件：37 ℃ 10 min，1次循环→95 ℃ 5 min，1次循环，95 ℃ 15 s→60 ℃ 60 s，共40次循环，每次循环结束读取荧光信号。

2 结 果

2.12组患者ApoE表型比较 ApoE表型分布在高血压组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，2组患者都以ε3/ε3表型最为常见，高血压组和对照组ε3/ε3表型分别占80.41%和75.47%。见表1。

表1 2组患者ApoE表型比较[n(%)]

2.22组患者ApoE等位基因频率比较 高血压组与对照组的ApoE等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，2组ε3等位基因检出频率最高。见表2。

表2 2组患者ApoE等位基因频率比较[n(%)]

2.3不同ApoE表型患者收缩压及舒张压水平比较 对照组ApoE E2、E3、E4表型患者收缩压及舒张压水平差异均有统计学意义(P<0.05)，E4表型患者(ε4等位基因携带者)收缩压及舒张压较其他等位基因携带者高。高血压组ApoE E2、E3、E4表型患者收缩压水平差异有统计学意义(P<0.05)，E4表型患者(ε4等位基因携带者)收缩压较其他等位基因携带者高。见表3。

表3 ApoE E2、E3、E4表型患者收缩压及舒张压水平比较

3 讨 论

ApoE在不同人群中的表型不一致，存在基因多态性。人群中ApoE等位基因频率最常见的是ε3,本研究结果与此相同。而ε2、ε4可能是天然进化过程中某一核苷酸突变形成的，在人群中占比较少。有研究表明，ApoE等位基因频率在不同国家有所不同，在各种疾病中，ApoE等位基因频率的分布亦有所不同[9-11]。血脂水平受ApoE基因多态性的调控，进而决定和影响动脉粥样硬化病变的发生和发展，ApoE基因多态性还存在种族差异，但结论尚不完全统一[12-14]。本研究主要探讨徐州地区ApoE等位基因多态性对高血压患者的影响，结果显示，对照组与高血压组患者ApoE表型分布差异无统计学意义(P>0.05)，且都以ε3/ε3表型最为常见。ApoE等位基因频率在高血压组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，ε3等位基因频率检出率在2组均最高。不同ApoE表型在对照组间收缩压及舒张压水平差异有统计学意义(P<0.05)，E4表型患者(ε4等位基因携带者)收缩压及舒张压较其他等位基因携带者高。高血压组患者中，ApoE E2、E3、E4表型患者收缩压水平差异有统计学意义(P<0.05)，E4表型患者(ε4等位基因携带者)收缩压较其他等位基因携带者高，而ApoE基因多态性与舒张压差异无统计学意义(P>0.05)。

本研究结果显示，ApoE等位基因ε4可能是高血压病发生、发展的危险因素之一。若能在无其他危险因素存在的高血压人群中进行ApoE等位基因频率的分析，并采用分子生物学技术对ApoE结构和功能进行深入分析，进一步揭示其对其高血压或其他疾病的机制，有望在高血压的早期预防和干预方面有所突破。由于本研究采纳的数据基数太小，且不同地区和人群ApoE等位基因分布也会有差异，下一步将扩大研究范围，为ApoE等位基因多态性对高血压患者的影响提供更详实的依据。