黄酮对发根农杆菌介导花生发根转化的影响

崔顺立 侯名语 胡晓辉 陈 静 刘立峰*

(1.河北农业大学,河北 保定 071001；2.山东省花生研究所,山东 青岛 266100)

毛状根是植物受发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导产生,最早于1907 年由Smith和Townsend发现。发根农杆菌诱导毛状根的生成主要依靠其体内的Ri质粒,该质粒独立于发根农杆菌染色体之外,由DNA 转移区(Transfer-DNA region,T-DNA)、毒性区(Virulence region,Vir)、复制起始区(Origin of replication,Ori)和冠瘿碱代谢功能区(OPine CAtabolism,OPCA)组成。植物组织受到发根农杆菌侵染时,侵染部位的细胞会产生酚类小分子物质,诱导活化Ri质粒的Vir区,Vir区调控Ri质粒的其他区完成侵染,产生毛状根,并改变植物体内代谢[1-2]。由于其生长速度快、遗传稳定、次生物代谢含量高等特点,在植物药用成份生产、植物基因功能研究、植物根际研究中得到广泛应用。

花生是世界上广泛种植的油料和经济作物,解析遗传机制、研究花生基因功能是促进花生产业发展的基础。花生植株中含有丰富的黄酮类多酚化合物[3-4],利用花生毛状根生产白藜芦醇等药用成份已有探索性研究[5-6]。槲皮素是花生中主要的黄酮类功能成份[3-4],具有细胞保护作用的强效抗氧化性和抗纤维化作用,在150 mg·d-1剂量下可下调收缩压。且在几种肿瘤细胞系中表现出抗癌和凋亡诱导作用,如结肠癌CT-26 细胞、前列腺癌LNCaP细胞、人前列腺PC3细胞、嗜铬细胞瘤PC12细胞、雌激素受体阳性乳腺癌MCF-7细胞、急性淋巴细胞白血病MOLT-4 T 细胞、人骨髓瘤U266B1细胞、人淋巴结Raji细胞和卵巢癌CHO 细胞[7]。利用花生毛状根生产槲皮素也将是解决槲皮素生产的重要方向。

因此,探索花生毛状根生长机理,对花生基因功能研究及药用成份生产具有重要意义。已有研究多围绕菌株种类、花生种质、外植体类型及培养基成份等进行探索,以提高发根转化花生的效率[5,8-11],但相关机理研究鲜见报道。已有研究表明农杆菌侵染植物时,会产生乙酰丁香酮类多酚化合物,促进农杆菌转化(Escudero 和Hohn,1997)[12]。乙酰丁香酮在农杆菌转化中得到广泛应用。花生中含有丰富的黄酮类多酚化合物[3-4],但对发根农杆菌转化所起的作用鲜有研究。本研究采用黄酮含量不同的花生种质进行发根转化,测定发根农杆菌的转化效率,以期为解析黄酮在发根农杆菌侵染花生中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用10个花生种质分别为:花育51号、花育36号、鲁花11 号、滦平大花生、冀花16号、濮科花9号、冀农花6号、P67-3、四粒红、东北王。其中滦平大花生、冀花16号、冀农花6号由河北农业大学花生研究室提供,其余7个由山东省花生研究所提供。均为2017年秋收获的花生种子,干燥后贮存于-20℃冰箱。

发根农杆菌菌株K599,由河北农业大学农学院葛淑俊老师提供。

1.2 侵染及发根诱导

干燥花生种子依次经75%乙醇浸泡1 min、无菌水清洗2次、0.1%氯化汞浸泡15 min、无菌水清洗3次后,接种在B5固体培养基上,于25℃、10 h光照/14 h黑暗下培养4 d。3次重复,每重复50粒。培养4 d的花生子叶作为外植体,剥去种皮,K599侵染15 min后接种于共培养基上,于黑暗条件下培养4 d后转接到不含任何激素的发根培养基上培养5 d,统计诱导发根数并计算发根诱导率。

发根诱导率/%＝产生发根的外植体数/接种外植体总数×100

pH 5.4的共培养基成份为:3.2 g/L B5+20 g/L蔗糖+0.4 g/L MES+0.8 g/L 琼脂+100 μmol/L乙酰丁香酮(AS)。pH 5.7发根培养基成份为:3.2 g/L B5+15 g/L蔗糖+0.4 g/L MES+0.8 g/L琼脂+250 mg/L头孢+100 mg/L特美汀(TIM)+100 mg/L万古霉素。

筛选5株长势良好的根系切下,接种到发根培养基上培养7 d,将根取出37℃烘干2 d,称质量。

1.3 毛状根GFP 基因PCR 验证

利用CTAB 法提取毛状根中的DNA[4]。根据发根农杆菌K599 T-DNA的基因序列(GenBank登记号EF433766),参考曹庆丰合成K599rolC基因扩增引物P1(5'-3'):ATGGCGGAATTTGACCTAT和P2(5'-3'):TTAGTTCCATCTGCCCATCC,设定扩增反应体系及PCR程序[13]。

采用1%琼脂糖凝胶电泳。引物在生工生物工程公司合成。Taq 酶购自宝生物工程公司,2 kb Marker购自博迈德生物公司,采用博迈德生物公司的5×DNA Loading Buffer with Gelred进行染色。

1.4 黄酮含量测定

总黄酮含量测定参照Hou等[4]方法。以芦丁(RT:Rutin)为标准品。总黄酮含量(TFC,Total flavonoid content)以每克花生籽仁质量(FM:Fresh Mass)含RT的μg当量值表示,即:μg RTE/g FM。

1.5 结果计算

采用Microsoft Excel 2010进行数据计算和绘图,用SPSS统计分析软件进行种子黄酮含量差异显著性检验(LSD法)。

2 结果与分析

2.1 花生种子黄酮含量

10个花生种质中,以花育51号黄酮含量最高,为670μg RTE/g FM,其次是冀花16号和冀农花6号,均极显著高于其他花生品种。含量最低的是四粒红和濮科花9 号,分别为408μg RTE/g FM,444μg RTE/g FM,显著低于其他品种。

种子萌发后3～4 d,其黄酮含量的变化趋势基本相同,均表现升高趋势,但至萌发后5 d时,黄酮含量变化出现分异,其中,东北王、四粒红、鲁花11号、花育51号、冀农花6号和濮科花9号等6个品种的总黄酮含量呈上升趋势,至第5 d升高幅度101.8～446.3μg RTE/g FM,以濮科花9号升幅最大；P67-3、花育36号、冀花16号和滦平大花生的黄酮含量在前4 d呈上升趋势,至第5 d时出现下降,以P67-3种质降幅最大,为227.8μg RTE/g FM(图1)。故选择各种质黄酮含量高的第4 d进行侵染转化。

图1 花生种子及萌发过程中总黄酮含量Fig.1 TFC in peanut seeds during germination process

2.2 发根农杆菌侵染花生种子结果

花生种子在B5培养基上萌发第4 d,胚根突破种皮0.2～0.5 cm 时进行侵染与共培养,发根培养基上第3 d开始长出发根(图2A、2B、2C)。根系培养5 d时进行PCR验证,以未转化的花生实生苗根作对照,含有rolC基因433 bp扩增条带视为转化根系。图3和图4示出,花育51号诱导率最高,为71.0%,其次是东北王,为66.0%,诱导率最低是冀花16号,仅为23.1%,濮科花9号诱导率30.4%,仅高于冀花16号。根系培养10 d后(图2D),其干质量以花育51号根最大,为0.047 g,最低为冀花16号,其质量仅为0.013 g(图4)。从整体趋势分析发现,诱导率高的种质根质量较高。

图2 发根农杆菌转化花生种子过程Fig.2 Transformation process of peanut seeds by Agrobacterium rhizogenes

图3 花生毛状根中发根农杆菌K599 rolC 基因PCR结果Fig.3 PCR amplification of rolC gene from Agrobacterium rhizogenes K599 in peanut hairy roots

图4 发根农杆菌转化花生种子诱导率Fig.4 Induction rate of transformation of peanut seeds by Agrobacterium rhizogenes

2.3 发根农杆菌侵染与花生种子黄酮含量关系

侵染时花生黄酮含量与发根农杆菌诱导率之间相关分析表明两者间呈线性负相关(图5),相关系数r＝-0.78,即花生体内的黄酮降低了发根诱导率。

图5 发根农杆菌诱导率与花生黄酮含量的相关关系Fig.5 Correlation between induction rate of Agrobacterium rhizogenes and TFC in peanut

3 讨论

黄酮作为植物体内抗氧化的次生代谢物质,在植物体抗病菌反应中起着重要作用。根瘤菌侵入豆科作物根系的第一步即是刺激植物体分泌黄酮类物质,黄酮在根瘤菌膜上扩散并诱导NodD(Nodulate D)蛋白质的合成,从而激活其他与结瘤有关的基因的转录[14]。可见,黄酮可以起到抗病菌作用,但在豆科作物上又是有利于根瘤菌侵染的物质。本研究结果显示黄酮不利于发根农杆菌侵染,而是起到了抗病作用。乙酰丁香酮类酚类化合物通过活化Vir区,诱导发根产生,黄酮类多酚化合物是否抑制了Vir区活化,或在Vir区诱导其他区活化时起到阻碍作用从而抑制了发根产生,有待进一步研究。另一方面,花生体内含有多种黄酮类化合物,在抗发根农杆菌侵染中起的作用可能不同。大豆发根抗镰刀菌Fusariumsolanif.sp.glycines侵染时,在大豆甙(daidzin)、黄豆甙(glycitin)、染料木甙(genistin)及三者各自的苷元前体、香豆雌酯(coumestrol)、大豆抗毒素(glyceollin)等8种异黄酮中,主要是大豆抗毒素起作用[15]。在进一步研究中应该明确花生中各黄酮在发根农杆菌侵染中的作用。