噬菌体疗法在疾病中的应用进展

符小妹，王悦，陈倩，郭晓奎，刘畅

1. 上海交通大学医学院免疫学与微生物学系，上海 200025； 2. 上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院，上海 200025

噬菌体作为能特异性感染细菌、真菌及放线菌的微生物，在环境中广泛存在。其经典应用主要体现在对耐药菌的治疗，已有多个临床成功案例，成为抗生素替代疗法中可操作性最强的方法之一。此外，随着对人体微生物群与宿主健康之间关系的研究不断深入，调控微生物群以达到预防或治疗疾病目的的方法引起了广泛关注。噬菌体具有宿主特异性，能通过与宿主菌间的相互作用裂解宿主菌，因此利用噬菌体靶向降低与疾病发展正相关的特征性细菌的丰度被视为一种精准靶向调控微生物群的可行策略，该策略在肿瘤、糖尿病和酒精性肝病等非感染性疾病中应用的临床前研究成果不断出现。

1 噬菌体的分类和作用特点

噬菌体是在环境中广泛存在的可感染原核细胞型微生物及真菌的病毒，对可感染的宿主菌具有特异性。噬菌体在人体肠道中的丰度达108～109/g粪便，是人体病毒组的主要构成部分[1]。根据形态结构特点，噬菌体可分为有尾噬菌体、无尾噬菌体及丝状噬菌体。国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)对噬菌体进行了系统的划分，将噬菌体中数目最多的以双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)为基因组的有尾噬菌体归为有尾噬菌体目，并进一步分为4个科：阿克曼噬菌体、肌尾噬菌体、长尾噬菌体和短尾噬菌体(https://talk.ictvonline.org/)。根据噬菌体感染宿主细胞后的生命周期，可分为烈性噬菌体和溶原性噬菌体[2]。烈性噬菌体在入侵宿主细胞后利用宿主的代谢机制进行核酸复制及蛋白质合成，组装成子代病毒颗粒后通过裂解宿主细胞而释放。溶原性噬菌体的遗传物质注入宿主体内后，可将自身基因组整合到宿主基因组中，形成前噬菌体。当外界环境发生变化如DNA损伤，这些噬菌体可自发地从宿主基因组中脱离，进入裂解期。但最新的观点认为，除这两种经典的噬菌体复制周期外，还存在第三种慢性感染周期。例如，丝状噬菌体感染宿主菌后可在宿主菌中长期慢性感染，合成子代噬菌体，通过专用分泌器释放出宿主菌，并不裂解细菌[3]。

烈性噬菌体在复制后期还可表达穿孔素和溶菌酶，通过穿孔素-溶菌酶相互作用特异性裂解细菌。穿孔素为一种疏水性蛋白，裂解过程开始后穿孔素在胞质膜上打孔，使裂解酶接触细菌细胞壁并水解肽聚糖骨架的共价键，破坏细胞壁，从而达到裂解宿主菌的目的[4]。

与抗生素不同，噬菌体的杀菌作用具有菌株特异性，对非宿主菌和真核细胞没有直接影响, 安全性强且精准性高。细菌会对噬菌体产生耐受性，如通过成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/ CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein，Cas)系统抵抗噬菌体的入侵[5]；而噬菌体也进化出相应的机制如表达anti-CRISPR蛋白来对抗细菌的耐受性[6]。此外，细菌感染过程中能形成生物膜，这种由多糖、蛋白质和脂类组成的网状结构使得抗生素难以渗透并发挥作用；而噬菌体可合成多种细菌胞外聚合物水解酶，对生物膜进行降解[7]。越来越多的证据表明，噬菌体还可通过影响人体共生细菌群的结构和功能来影响宿主健康[8-10]。

2 噬菌体疗法在感染性疾病中的应用

噬菌体最早被用于治疗伤寒、痢疾、皮肤感染和外科伤口感染等感染性疾病[11]。早期噬菌体疗法存在一定局限性，如缺乏科学的方法设计、质量控制、标准化生产等。更重要的是，抗生素被发现后，其显著的治疗优势使得噬菌体疗法相关研究大量减少，仅局限于东欧少数国家[11]。目前，由于耐药菌在世界范围内不断播散以及新抗生素研发周期变长，噬菌体疗法再次得到重视。噬菌体疗法主要分为单一噬菌体疗法或多种噬菌体混合的鸡尾酒疗法，后者可有效减缓治疗过程中耐受菌产生的速度[12]。噬菌体疗法给药方式包括局部、口服及静脉注射。其临床创新用法也在不断开发中，包括噬菌体-抗生素组合、噬菌体衍生酶、噬菌体生物工程等[13-14]。Ott等对5例有症状的慢性复发艰难梭菌感染(Clostridioidesdifficileinfection，CDI)患者进行无菌粪便滤液 (fecal filtrate transfer，FFT)治疗，结果显示所有患者至少在6个月内恢复了正常大便习惯，消除了CDI症状，表明FFT中的细菌成分、代谢物或噬菌体发挥了作用，并且大大降低了粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)转移不确定的活细菌的安全性风险[15]。

噬菌体疗法目前尚未被列为常规的细菌感染治疗手段，但越来越多的多重耐药菌感染病例获得了噬菌体疗法许可。表1列举了一些近几年使用噬菌体治疗多重耐药细菌感染的临床个案，包括败血症、尿路感染和关节感染等。虽然未经过大规模的临床试验，但这些结果对于建立现代噬菌体治疗方案有帮助。在未来几年，噬菌体治疗感染性疾病的临床研究会不断增加。

表1 噬菌体疗法的临床病例

3 噬菌体疗法在非感染性疾病中的应用探索

多项研究显示，人体微生物群主要是肠道菌群，与人体健康密切相关，肠道菌群结构及其相应代谢产物的变化与肥胖、肠易激综合征、癌症、抑郁、动脉粥样硬化和自闭症等多种非感染性疾病的发生发展相关[24-27]。随着对人体微生物群与宿主健康之间关系的研究不断深入，通过调控人体微生物群来辅助治疗或预防疾病的策略成为疾病干预方向之一。现有的靶向微生物群的治疗策略如抗生素、益生菌、FMT等均存在引起感染、携带耐药基因等安全风险，同时对微生物群的整体组成存在影响，且精准性不足，因此疗效较难评价。基于噬菌体的作用特点，噬菌体疗法有望成为精准调控人体微生物群的策略之一。近年来，该策略尝试用于炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、糖尿病及酒精性肝病等动物模型，获得了有效结果。在肿瘤免疫治疗中，影响治疗效果的肠道菌也可作为噬菌体的调控靶标而有望 “增效”[28]。

3.1 IBD

IBD包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，是一种慢性复发性胃肠道疾病。IBD的确切病因尚不明确，但被认为是环境因素与遗传易感性相互作用，最终导致黏膜免疫异常应答[29]。许多研究发现，IBD患者肠道微生物群的生物多样性显著降低[30-31]。在CD患者肠道黏膜中，具有黏附性的侵袭性大肠埃希菌(adherent invasiveEscherichiacoli，AIEC)的定植概率显著增加，而针对AIEC定植提出的治疗策略包括抗生素治疗、FMT、营养干预或给予益生菌治疗等结果均不理想[32]。一项针对AIEC的噬菌体疗法取得了较好结果：研究人员筛选了3种烈性噬菌体，混合后进行动物实验，结果显示噬菌体能在AIEC定植的小鼠回肠、盲肠和结肠中复制，引起AIEC水平下降伴随结肠炎症状减轻[33]。

近年来，关于IBD与肠道噬菌体组关系的研究逐渐增多。有研究表明，与对照组相比，CD患者的噬菌体增多[34]。一项针对UC、CD患者及正常人粪便中病毒样颗粒测序和细菌16S rRNA序列的详细分析显示，UC和CD患者中有尾噬菌体丰度增加，更重要的是随着IBD相关噬菌体丰度显著增加，细菌的丰度和多样性下降。该研究首次表明，肠道病毒组的噬菌体成分在CD和UC患者中发生了独特变化，可能增加了发病的可能性[35]，这为发现IBD的病毒诊断标记和开发新治疗策略提供了理论基础。

然而，在小鼠模型中噬菌体干预可能导致天然免疫和适应性免疫增强，这是噬菌体本身或噬菌体裂解导致细菌释放脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等的结果。有研究发现，噬菌体可作为抗原结合Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR9)，激活肠道黏膜的干扰素γ(interferon γ，IFNγ)通路而加剧肠炎症状。因此，在实际应用之前，需要精确评估噬菌体干预对免疫系统的影响[36]。

3.2 结直肠癌(colorectal cancer，CRC)

多项研究表明，结肠菌群失调是CRC发生的重要原因之一。有证据显示，具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，Fn)能促进CRC的发生[26,37]。与CRC发生发展相关的微生物还包括脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)及AIEC等[38]。鉴于肠道菌群与CRC之间的关系，辅助治疗和预防CRC的菌群调控策略备受关注[39]。

来自武汉大学的研究团队报道了一种噬菌体介导的纳米药物，他们选择了一株可特异性抑制Fn生长的温和噬菌体并通过化学方法将其叠氮化，然后将叠氮化的噬菌体与加工过的化学药物连接，形成以噬菌体为载体的纳米药物。动物实验证明该噬菌体能抑制Fn增殖，并介导药物在肿瘤组织局部富集，提升了CRC的化疗效果[40]。近期，该研究团队又利用噬菌体展示技术构建了一株表达特异结合Fn蛋白的M13噬菌体，并将纳米银(silver nanoparticle，AgNP)颗粒静电组装在其表面衣壳蛋白(M13@Ag)上，实现了对Fn富集部位的精确识别，继而促进药物在肿瘤组织发挥作用[41]。他们的研究主要将噬菌体作为药物载体而非直接利用噬菌体的杀菌能力，增加了其通用性。另一个研究团队则使用AIEC特异性噬菌体治疗AIEC定植的CRC小鼠，结果显示AIEC定植显著减少，肿瘤缩小，小鼠生存率提升。与此相一致的是，小肠组织转录组分析显示，与肿瘤生长、转移和胃肠道癌侵袭有关的基因在噬菌体治疗的小鼠体内表达明显下调[36]。以上这些结果为肠道肿瘤的治疗提供了新思路。

3.3 2型糖尿病

糖尿病严重威胁全球人类健康，多项研究表明2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)与肠道微生物群改变有关，但二者之间的因果关系与潜在机制仍有待研究[42,43]。一项对71例T2D患者和74例正常人粪便标本进行的肠道噬菌体组分析显示，T2D组的肠道噬菌体数量显著增加，并且确定了7种与T2D具有相关性的噬菌体操作分类单元(phage operational taxonomic unit，pOTU)[44]。这一发现在包含116份 T2D患者样本和109份对照样本的独立数据集中得到进一步验证[44]。该研究还对肠道菌群与pOTU进行分析，发现了人类肠道生态系统中细菌与噬菌体之间复杂的相互作用，表明肠道噬菌体的显著变化不能简单地用与细菌宿主共变异来解释[44]。

受FFT成功治疗难治性CDI的启发，Torben等对高脂饮食小鼠进行粪便病毒移植(fecal virome transplantation，FVT)，发现在接受了低脂饮食瘦小鼠的粪便病毒组之后，FVT组小鼠体重增加幅度明显降低，葡萄糖耐受性恢复正常。同时，与高脂饮食小鼠相比，FVT组小鼠肠道病毒和细菌多样性更接近于瘦小鼠，菌群结构发生显著改变。FVT组小鼠脂肪代谢相关基因的表达发生显著改变，肝脏和回肠组织中瘦素信号转导、糖代谢和脂解相关的7个基因差异表达，可能影响糖耐量和体重增加。该研究为设计针对人类肥胖和T2D的FVT临床研究提供了基础，强调了在粪便移植治疗中去除细菌的观点，这样才能降低细菌引起的侵袭性感染[45]。

3.4 酒精性肝病

长期大量饮酒引起的酒精性肝病是全球性疾病负担，初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化[46]。一项关于酒精性肝病与肠道微生物的研究发现，小鼠体内肠道微生物能促进酒精引起的肝脏疾病[47]。最新研究发现，与对照组相比，酒精性肝炎患者肠道中产溶细胞毒素的粪肠球菌数量显著增加，且溶细胞毒素产量与疾病严重程度和死亡率有关，约90%的溶细胞毒素阳性患者在入院后180 天内死亡，而溶细胞毒素阴性患者中这一比例为4%。研究人员筛选出4株靶向产毒素粪肠球菌的噬菌体，制备成噬菌体混合液，对产毒素粪肠球菌定植的小鼠进行灌胃治疗，结果表明噬菌体能降低肝脏中的溶细胞毒素，并减轻酒精引起的小鼠肝脏病理改变[48]。

3.5 高血压

研究表明，肠道微生物群与高血压的发生有重要关系[49-50]。Weinbauer等对来自健康组、高血压前期组和高血压组的196份粪便标本进行病毒组学研究，发现了397个病毒类群，其中几种病毒在3组之间有显著性差异，如链球菌噬菌体phiAbc 2、克罗诺杆菌噬菌体(Cronobacterphage)CR3和C.medinalis颗粒病毒[51]。这些以噬菌体为主的病毒首次被发现与高血压的发生存在联系，推测其可能参与调节肠道菌群的组成，从而影响高血压的发展。此外还发现，与细菌相比，病毒具有更好的分辨和鉴别高血压样本的能力。虽然病毒与高血压之间的关系尚不清楚，但这并不妨碍选择将病毒作为诊断高血压分期的潜在生物标记。在高血压患者中还发现了越来越普遍的“病毒-细菌”连锁模式。这些结果均表明肠道病毒的改变与高血压有关[51]。

4 结语

4.1 噬菌体在感染性疾病治疗中应用的局限性

虽然采用噬菌体治疗严重感染的成功案例不断增加，但目前噬菌体疗法仍存在许多问题亟待解决，其中最重要的是噬菌体制剂的安全性和有效性。作为一种有活性的生物制剂，其生产标准和要求不能完全沿用药物生产标准，但目前还没有明确的指南对标人用噬菌体的生产，相关规范和要求有待完善。公认的对治疗性噬菌体的要求是不含有编码溶原性、毒力因子及抗生素耐药的基因，然而这可能会导致在一些细菌中使用噬菌体疗法受限，如目前还未发现以艰难梭菌为宿主的烈性噬菌体[52]。还需考虑到烈性噬菌体短期大量裂解细菌可能会导致蛋白质、LPS和核酸过度积累，进一步加剧炎症的问题[35]。令人鼓舞的是，迄今为止噬菌体疗法相关临床研究均未发现噬菌体引起的严重不良反应[53]。此外，制备成本较高、噬菌体制剂稳定性的保持以及快速筛选噬菌体方法的开发等都是需要在应用中解决的问题。

4.2 利用噬菌体调节肠道微生物群的思考

利用噬菌体调节肠道微生物群来辅助治疗疾病正处于起步阶段，不仅面临与感染性疾病治疗相同的问题，还有其他挑战。首先是基础研究相对不足，虽然能在一些疾病中观察到微生物组成改变，但是这些改变的机制仍未探明，仅有少数研究表明微生物群改变与疾病存在明确的因果关系。因此，噬菌体组与疾病的关系还有待在更多人群中进行检测和分析。限于目前的数据分析水平，人体噬菌体组尚未被全面了解。宏基因组学研究证实，肠道内80%～90%的噬菌体未被注释，已知的噬菌体仅占人体肠道噬菌体的少部分[54]。新的生物信息学工具和逐步丰富的参考数据库提供了更精确的分辨率，将会进一步促进肠道噬菌体相关研究。此外，噬菌体颗粒可能会作为免疫原触发机体免疫反应[55]，而免疫系统对各种噬菌体相关抗原在肠道系统的反应还未得到充分探索。因此，虽然在本综述涉及病例中已观察到噬菌体调控菌群的作用，但其具体机制仍有待明确。

4.3 展望

由于噬菌体疗法在感染性和非感染性疾病的预防和辅助治疗中有潜在应用前景，其从基础研究向临床转化势在必行。然而，利用噬菌体或其他微生态制剂干预肠道微生物群并不能取代疾病常规治疗手段，只是提供了一种辅助治疗方式以延缓病程，或在一定程度上起到预防作用，不能罔顾实验证据而夸大调控微生物群的作用。目前，人体微生物群与健康之间存在联系的证据越来越明确，因此不应忽视调控微生物群对疾病治疗的作用，在深入的基础研究、有效的临床试验、革新的监管体系，以及相应的教育和培训等多方位共同推进下，噬菌体疗法有望在医疗实践中得到进一步验证。