牙周基础治疗后龈沟液中4种生物标志物水平变化及临床意义

张倩，陈斌，闫福华

1.南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院儿童口腔科，江苏 南京（210008）；2.南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院牙周病科，江苏 南京（210008）

牙周炎是人类最常见的口腔疾病之一，慢性牙周炎发病率高、早期症状不明显，不易引起重视，而当出现牙齿松动、疼痛等症状时，已发展为重度牙周炎，可致牙齿松动、脱落，严重影响患者的健康和生活质量［1-3］。因此，对牙周组织破坏进行早期诊断、判断牙周基础治疗的疗效和牙周炎的预后具有重要意义。牙菌斑是牙周炎的始动因子，但是宿主的免疫反应决定了牙周组织破坏的进程。龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）作为一种牙周的局部渗出液，一定程度上可以反映宿主的免疫反应。由于GCF收集方法简单且无创，采用GCF作为牙周炎早期诊断或预测牙周组织破坏的指标，具有非常良好的应用前景。虽然已有关于不同牙周状态下GCF中细胞因子水平的相关研究［4-6］，但目前国内尚无在牙周基础治疗后随访期间出现牙周炎进展的位点GCF中进行细胞因子检测的研究。GCF成分众多，本研究选取了与牙周组织破坏有关的2种常见促炎因子——肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和白细胞介素6（interleukin 6，IL-6），抗炎因子白细胞介素10（interleukin 10，IL-10），在骨代谢中发挥重要作用的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），观察重度慢性牙周炎患者治疗前后GCF中以上4种生物标志物水平，探讨GCF中生物标志物水平对于判断牙周基础治疗的疗效和随访期间局部出现牙周炎进展的临床意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象

本项研究经南京大学医学院附属口腔医院伦理委员会批准（批准号：2013NL-007），并在中国临床试验中心注册（注册号：ChiCTR-OCH-13004679），所有受试者在进入研究前均对本研究知情同意并签署了知情同意书。

选择就诊于南京大学医学院附属口腔医院牙周病科的患者，根据纳入标准，有30例患者（男性11例，女性19例，年龄40～56岁）参与并完成了这项2015年12月～2016年12月为期1年的纵向试验研究。

依据1999年牙周病分类标准［7］，纳入标准：①40岁及以上年龄、至少有14颗可评估的牙（其中有4颗磨牙）；②全身健康无系统性疾病，无吸烟史，妇女未妊娠；③至少3个月内未使用过抗生素；④1年内无牙周治疗史；⑤全口1/3以上的患牙满足以下条件：牙周支持组织的破坏超过根长1/3；Ⅱ度或Ⅲ度根分叉病变；探诊深度（probing depth，PD）>6 mm；临床附着丧失（clinical attachment loss，CAL）≥5 mm。

同时招募了15例牙周健康志愿者作为重度慢性牙周炎患者基线时的对照（男性6例，女性9例，年龄22～35岁，无全身系统性疾病，无吸烟史，PD＜3 mm，没有附着丧失和牙槽骨吸收，全口探诊出血阳性位点≤20%）。

1.2 基线牙周临床检查、龈沟液的收集

对参与者进行初步的牙周检查，仅包括菌斑指数（plaque index，PLI）、牙齿松动度和影像学检查（全景片或锥形束CT）［8］。根据龈缘位置和影像学检查显示的牙槽骨位置预估慢性牙周炎患者的PD，对预估PD≥6 mm（深袋）和PD≤4 mm（浅袋）的位点采集GCF，以避免探诊后采样导致牙周袋内GCF被干扰，从而获得相对真实的结果。

取样之前，用棉卷隔湿，然后使用无菌刮匙刮除龈上菌斑，气枪轻轻吹干后，将尺寸为2 mm×8 mm的无菌滤纸（Whatman，美国）放入牙周袋中，直到感到阻力为止，30 s后取出［7］。然后将滤纸条放入预先称重的无菌Eppendorf管中。如果滤纸被血液或唾液污染，则将其丢弃并选择另一个位点。2 min后，再次使用相同的方法从相同的位置收集GCF，并将试纸条放入相同的试管中。所有GCF样品均由同一人收集。使用精密电子天平（Mettler-Toledo，XS205，梅特勒-托利多，中国）称取采样前后滤纸的重量，两次的重量差就是GCF的重量，以龈沟液的比重为1 mg/μL计算GCF的体积。将样品密封并保存在-80℃待检。

待采样结束再使用牙周探针（Hu-Friedy，美国）测量并记录龈沟出血指数（sulcus bleeding index，SBI）、PD、CAL［8］，当实际也满足6 mm≤PD≤9 mm或PD≤4 mm时将该样本纳入研究，反之则剔除。最终每例患者收集2个深袋位点和2个浅袋位点纳入研究。所有临床检查均由同一位经验丰富的牙周病专科医生进行。以相同的方式收集并保存了15名牙周健康志愿者中30个健康牙位的GCF。

1.3 牙周基础治疗及牙周临床指标测量

在基线GCF采样和牙周临床指标记录后，每例患者均接受了由同一位经验丰富的牙周病专科医生进行操作的牙周基础治疗，包括口腔卫生宣教、龈上洁治、全口龈下刮治和根面平整。在基础治疗后1、3、6和12个月随访时，对每例患者进行重新评估，记录数据，按照上述方法取同样牙位的GCF，-80℃冰箱保存待检。随访治疗主要包括有针对性的强化口腔卫生指导、龈上洁治，2次随访期间CAL增加≥2 mm的位点被认为是牙周炎活动期位点，即这些位点出现了牙周炎进展，对这些位点需要再次进行龈下刮治。

1.4 GCF中IL-6、IL-10、TNF-α、ALP水平的检测

将收集到的样品在同一日检测。检测当天，将Eppendorf管中的GCF样品在室温下融化，并在摇床上以150 rpm的转速用500μL去离子水洗脱1 h，10 000 rpm转速离心10 min后，去除上清液。

用酶联免疫吸附测定法（ELISA）（IL-6、IL-10、TNF-α试剂盒购于美国R＆D公司；ALP试剂盒购于美国Cloud-Clone公司）检测龈沟液中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP含量，严格参照试剂盒说明书进行操作。试剂盒中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP的平均最低可检测剂量分别为0.039 pg/mL、0.063 pg/mL、0.049 pg/mL和1.27 ng/mL。如果某位点的生物标志物水平测出来低于最低值，则认为该位点水平不可测，剔除该位点。通过标准曲线计算生物标志物的浓度，然后乘以体积就是该生物标志物的水平，计算为pg/牙位。

1.5 统计学分析

使用统计软件SPSS 20.0中文版分析数据，GraphPad Prism 5做图。使用Wilcoxon符号秩和检验比较基线时和治疗后1、3、6和12个月时GCF中牙周临床指标和生物标志物水平的组内比较，Mann-WhitneyU检验比较两组之间牙周临床指标以及GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平的差异。GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平与牙周临床指标之间的相关性采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线期重度慢性牙周炎患者不同位点、健康对照者GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平

基线期重度慢性牙周炎患者未经治疗的牙周炎位点GCF中IL-6、TNF-α、ALP水平显著高于对照组牙周健康者的位点（P＜0.001），IL-10水平显著低于对照组（P＜0.001）。此外，重度慢性牙周炎患者深袋位点的GCF中TNF-α、ALP、IL-6水平显著高于浅袋位点（P<0.001），IL-10水平显著低于浅袋位点（P<0.001）（表1）。

2.2 基础治疗后1、3、6、12个月重度慢性牙周炎患者不同位点GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平和临床指标

2.2.1 生物标志物水平 牙周基础治疗后1、3、6、12个月，与基线期相比，重度慢性牙周炎患者浅袋、深袋位点GCF中的TNF-α、ALP水平显著降低，IL-10水平显著升高（P＜0.005），但是IL-6水平只在深袋位点GCF中显著降低（P＜0.005），浅袋位点的IL-6水平变化差异无统计学意义（P>0.05）（图1）。

表1 基线期重度慢性牙周炎患者牙周炎位点和对照组健康位点GCF中生物标志物的水平Table 1 Levels of biomarkers in GCFat periodontitis sites in patients with severe chronic periodontitis at baseline and healthy sites in the control group Median(IQR)

Figure 1 Levels of IL-6,TNF-α,IL-10,and ALP in the GCF of deep-pocket and shallow-pocket sites at the baseline and 1,3,6 and 12 months after nonsurgical periodontal therapy图1 基线及牙周基础治疗1、3、6、12个月深袋、浅袋位点GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP的水平

2.2.2 临床牙周指标 牙周基础治疗后1、3、6、12个月，重度慢性牙周炎患者深袋和浅袋位点的PD和CAL与基线相比，明显下降，差异有统计学意义（P＜0.005）。深袋位点的PLI和SBI与基线相比，基础治疗后明显下降，差异有统计学意义（P＜0.005）；浅袋位点的PLI和SBI，治疗后有一定下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

Figure 2 Clinical indicators of deep pocket and shallow pocket sites at the baseline and 1,3,6 and 12 months after nonsurgical periodontal therapy图2 基线及牙周基础治疗1、3、6、12个月深袋、浅袋位点的临床指标

2.3 GCF中生物标志物水平与牙周临床指标之间的相关性

GCF中IL-6、TNF-α水平和ALP与牙周临床指标（PD、CAL、PI、SBI）间存在有统计学意义的正相关（P<0.05），而IL-10水平与牙周临床指标呈负相关（P<0.05），具体相关系数及P值见表2。其中GCF中4种生物标志物水平与PD、CAL的相关性更大。

表2 牙周临床指标与GCF中生物标志物水平的相关性Table 2 Correlation between periodontal parameters and the levels of biomarkers in GCF

2.4 GCF中生物标志物水平与该位点牙周炎进展间的关系

在牙周基础治疗后1、3、6、12个月的随访期间，≥90%的牙周炎位点没有新的附着丧失，这些位点GCF中IL-6、TNF-α、IL-10和ALP水平相较上一次，差异均无统计学意义（P>0.05）（图1）。但是，有不超过10%位点出现了牙周炎进展，这些位点GCF中的IL-6、TNF-α、IL-10和ALP水平与上一次检查相比，差异均有统计学意义（P＜0.005）（表3）。

3 讨论

目前临床上常用牙周临床指标如附着丧失、探诊深度、骨丧失、牙齿松动、牙齿移位、牙菌斑指数、牙龈退缩和影像学表现来反映牙周炎症和牙周治疗的效果。但是，这些指标存在一定的滞后性，并且带有一定的主观性。因此，寻找一种更准确、更灵敏并且能够客观地评估牙周状态、预测牙周组织破坏的方法是很有必要的。

GCF是一种血清渗出液，它包含血清的许多成分和局部产生的生物标志物。研究发现，GCF中数十种生物标志物可用于评估牙周炎的发生和发展［9-10］，研究GCF用于牙周炎的诊断、治疗评估以及疾病发展的监测是当前牙周病学的重要课题之一［11-12］。在炎症状态下，许多细胞因子、酶和蛋白质，被释放到GCF中［6，13］。在这些生物标志物中，IL-6是与牙周组织破坏有关的促炎因子，被认为与牙周疾病的进展有关［14-16］。研究者认为，IL-6在激活炎症介质释放的同时还可以促进炎症细胞聚集［17］。同样，TNF-α可以激活破骨细胞并促进骨吸收，与牙周病的发展密切相关［18］。抗炎因子IL-10则可以抑制一系列促炎因子的产生，例如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、基质金属蛋白酶等［19］，同时IL-10也参与调节了骨吸收过程［20］。ALP是骨代谢、炎症反应和牙周再生中一种重要的酶，白细胞、巨噬细胞、成骨细胞和成纤维细胞等许多细胞均可产生碱性磷酸酶［21］。

表3 牙周基础治疗后1、3、6、12个月，出现牙周炎进展的位点GCF中生物标志物水平Table 3 Levels of biomarkersin GCFat the sitesof periodontitis progression 1,3,6,and 12 months after nonsurgical periodontal therapyx±s

目前已经有研究通过检测牙周炎患者GCF中的成分来评估牙周组织的炎症状况或牙周治疗的效果［22-24］。还有研究通过测量GCF中炎性介质水平来评估个人患牙周疾病的风险［9，25］。然而，本研究采样方法较其他研究有一定先进性，即采样前不探诊，根据龈缘位置和影像学检查显示的牙槽骨位置预估PD，以避免探诊后采样导致牙周袋内GCF被干扰，从而获得相对真实的结果。本研究结果显示，重度慢性牙周炎患者的炎症位点IL-6、TNF-α和ALP水平显著高于志愿者的牙周健康位点，对照组牙周健康位点的IL-10水平高于牙周炎患者炎症位点的IL-10水平，说明不同牙周状态下GCF中以上4种生物标志物水平不同，这与以前研究结果的趋势基本一致［16，18，26-27］，说明本研究选取的这4种生物标志物有一定的代表性。

此外，本研究结果显示，同一患者不同位点GCF中4种生物标志物水平亦不同，在患者深袋位点GCF中IL-6、TNF-α和ALP水平的水平显著高于浅袋位点的水平，深袋位点GCF中IL-10水平显著低于浅袋位点水平，进一步证明了IL-6、IL-10、TNFα和ALP能反映该位点的牙周状态。

同时，本研究发现临床指标（PD、CAL、PLI和SBI）与IL-6、IL-10、TNF-α、ALP水平之间存在显著相关性，这些结果说明GCF中生物标志物的水平与牙周组织破坏的程度相关。其中，GCF中4种生物标志物水平与PD、CAL的相关性更大。

有研究表明，在菌斑控制良好的基础上，在一些深牙周袋也可以通过牙周基础治疗达到良好的治疗效果，无需进一步的手术治疗［28-30］。迄今为止，许多研究报道了基础治疗后GCF中生物标志物的变化［31-33］。本研究中，基础治疗后，重度慢性牙周炎患者浅袋、深袋位点GCF中的TNF-α和ALP水平显著降低，IL-10水平显著升高，但是只有深袋位点GCF中的IL-6水平显著降低，浅袋位点的IL-6水平变化差异无统计学意义，说明IL-6的敏感程度可能不如其他3种生物标志物。此外，这4种生物标志物水平在深袋位点的变化比浅袋位点更显著。通过检测GCF中的TNF-α、IL-10、ALP，可评估牙周基础治疗效果。本研究结果与以往的研究结果的变化趋势基本一致［34，19，32-35］，但具体数值并不相同，原因可能包括种族原因、个体差异、不同的样本量和不同的测量方法，后续可能需要更多的样本量，以提供更准确的结果。

本研究结果显示，在基础治疗后1、3、6、12个月的随访期间，90%以上位点GCF中的IL-6、TNFα、IL-10、ALP水平与上一次相比，差异无统计学意义。两次随访之间有部分位点的CAL增加≥2 mm，即这些位点出现了牙周炎进展，可能是由于清创不彻底和/或口腔卫生不佳导致的，在这些位点的GCF中，TNF-α、ALP、IL-6水平显著升高，IL-10水平显著降低。这说明，GCF这4种生物标志物可能是评估局部位点牙周炎进展的有价值的指标。

综上，本研究检测重度慢性牙周炎患者不同位点中GCF中细胞因子和酶水平，以评估其水平与牙周状态的关系，以及判断牙周基础治疗的疗效和牙周炎的预后，这是国内首次对牙周基础治疗后随访期间发生了牙周炎进展的位点进行GCF中TNF-α、IL-10、IL-6炎症因子和ALP的检测，结果表明，GCF中这4种生物标志物表达水平作为炎症相关指标可辅助判断重度慢性牙周炎患者局部位点的牙周炎进展情况及牙周基础治疗的疗效，将来可能作为预测牙周组织破坏程度的敏感指标应用于临床。

【Author contributions】 Zhang Q collected the GCF samples，performed the research，analyzed the data and wrote the article.Chen B performed the periodontal treatment and revised the article.Yan FH designed the study and revised the article.All authors read and approved the final manuscript submitted.