鞍带石斑鱼isg15 基因cDNA 克隆及其在虹彩病毒感染下的表达分析

马 腾 王 磊 赵玉柱 吴垚磊 周 茜 陈张帆 朱春华 陈松林

(1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 山东 青岛 266071；2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306；3. 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)广东省名特优鱼类生殖调控与繁育技术工程中心 广东海洋大学 广东 湛江 524088)

干扰素(interferons, IFNs)是一种在脊椎动物的抗病毒防御(Cocciaet al, 2015; Skauget al, 2010)、免疫激活(Linet al, 2014; Blomstromet al, 1986)和细胞增长调节(Lenschowet al, 2007; Cunhaet al, 1996)过程中起着重要作用的细胞因子(Yooet al, 2014; Zhaoet al, 2005)。目前，已知的I 型和Ⅱ型ifn基因在鱼类对病毒感染的先天免疫和适应性免疫中起关键的抗病毒防御作用(Zouet al, 2011; Liuet al, 2010; Baecket al, 2008)。被病毒感染的细胞识别病毒的dsRNA，且触发 IFNs 基因与其同源受体结合，进而启动JAK/STAT 信号联系，导致干扰素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的转录诱导过程(Robertsenet al, 2006; Liuet al, 2002; Loebet al, 1992)。干扰素刺激基因是先天免疫系统的主要部分，对限制细胞内和细胞间的病毒复制和传播非常重要，ISGs 的作用机制对靶向目标有效的抗病毒感染起着至关重要的作 用(Hubelet al, 2019; Yasuikeet al, 2011;Giannakopouloset al, 2009)。ISG15 是一种可以作用于细胞内的抗病毒蛋白(Danielet al, 2017; Ozatoet al,2008)，它可以通过病毒与细胞蛋白结合在细胞内发挥作用，或者可以作为细胞因子作用于细胞外(Morenoet al, 2018; Okumuraet al, 2007)。鱼类中，ISG15 是鱼体被病毒感染后经干扰素诱导最早表达且表达量最高的蛋白之一(Álvarezet al, 2018; Zhanget al, 2007)。Liu 等(2010)研究报道，美国红鱼(Sciaenops ocellatus)的ISG15 同源物能够直接表现出免疫调节的特性。鳕(Gadus morhua) (Røkeneset al, 2007)、鲑(Salmo salar) (Seppolaet al, 2007)和鲫(Carassius auratus) (Furneset al, 2009)的ISG15 同源物能够与细胞蛋白形成复合物发挥抗病毒的作用。因此，isg15不仅能够调节免疫反应，还具有直接的抗病毒作用，研究鱼类isg15对于解析鱼类抗病毒分子的免疫机制具有重要意义。

高职院校从事跨语言文化教学的教师很多不具备跨文化背景和交流经验，深入开展跨文化教学时显得力不从心，有些教师在处理跨文化教学上缺乏一定的经验、方法和技巧。

鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)是一种名贵的海水养殖品种，随着消费需求的增长，养殖密度不断增加，病害问题已成为制约石斑鱼类养殖业健康可持续发展的主要瓶颈。目前，虹彩病毒(iridovirus)是海水和淡水养殖鱼类最严重的病毒性病原之一，在世界各地已从 100 多种鱼类中分离鉴定出虹彩病毒(Grayet al, 2015)。虹彩病毒是危害石斑鱼类最大的传染病之一(Ohtaet al, 2011)，但关于鞍带石斑鱼干扰素刺激基因15 的克隆及功能研究尚未见报道。

本研究以鞍带石斑鱼为研究对象，对其isg15基因进行全长cDNA 克隆并初步分析其结构特征，采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测了该基因在鞍带石斑鱼不同组织中的表达模式，以及感染虹彩病毒后主要免疫组织的表达特征，旨在为探究isg15基因在鞍带石斑鱼免疫应答中的作用机制提供数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 正常组织 本实验所用的鞍带石斑鱼取自海南晨海水产有限公司，采集18 月龄健康鞍带石斑鱼，麻醉后用注射器对心脏取血，然后解剖取其心脏、肝脏、鳃、肠、皮肤、肾脏、脾脏、脑等组织，将组织样品立即放入RNA 保存液中，存放于-80℃冰箱，用于提取正常组织RNA。

《普通高中数学课程标准(实验)》强调：“数学教学要使学生通过不同形式的自主学习、探究活动，体验数学发现和创造的历程.”从数学学科特点出发,根据不同的教学内容,有效合理地组织学生开展“探究教学”，是追求有效教学、构建高效课堂的重要途径.在目前课堂教学中，“探究教学”中探究的成分太少,有种“贴标签”的嫌疑.笔者认为，数学课堂教学过程中的每一个环节都可以渗透探究的元素、探究方法、探究思想.我们应力求让探究成为数学课堂教学的常态,应善于把握课堂教学中的每一个探究机会和细节，使数学探究逐步成为学生学习的自觉行为乃至形成习惯,促进学生思维充分、健康、全面发展.

康鞍带石斑鱼腹腔注射虹彩病毒(由华南农业大学的秦启伟教授提供)进行感染，每尾100 μL (109拷贝数)。在感染后的0、12、24、72 和96 h 共5 个时间点，以磷酸缓冲液(PBS)作为对照，分别取5 尾鞍带石斑鱼，将活鱼麻醉后迅速采集脾脏和肾脏组织，放入RNA 保存液中，存放于-80℃冰箱。

1.2 鞍带石斑鱼总RNA 提取及cDNA 第一链的合成

用于全长克隆的总RNA 提取按照RNAiso Plus Total RNA (TaKaRa)提取试剂说明书进行操作，提取的 RNA 经琼脂糖凝胶电泳检查完整性，并利用NanoDrop2000 超微量分光光度计测定RNA 浓度及纯度，判断核酸和蛋白质的污染情况。选取质量良好的RNA，按照PrimeScript Ⅱ 1st strand cDNA synthesis kit (TaKaRa)和SMARTer RACE 5′/3′ kit 的操作说明书进行反转录，分别得到cDNA、5'RACE cDNA 及3'RACE cDNA，保存至-20℃冰箱，分别用于isg15基因中间片段的克隆以及5′RACE 和3′RACE 扩增。

1.3 isg15 基因的全长cDNA 的克隆

1.3.1 中间片段的克隆验证 中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林团队主导完成了鞍带石斑鱼全基因组测序和精细图谱绘制(Zhouet al, 2019)，首先，根据鞍带石斑鱼基因组数据库中的部分isg15序列，使用Primer Premier 5.0 软件设计引物(isg15-F1/isg15-R1)(表1)，以cDNA 为模板进行PCR 扩增：Mix 7.5 μL，isg15-F1 0.6 μL，isg15-R1 0.6 μL，ddH2O 5.3 μL，模板cDNA 1 μL。程序：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸55 s，35 个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶回收试剂盒回收、纯化，再利用T-A 克隆方法克隆到pEAZY-T1 载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞中，涂板于含氨苄西林的固体培养基，37℃过夜培养12～16 h，挑取单菌落于1 mL含氨苄西林的液体培养基中，37℃ 200 r/min 震荡培养6 h，进行菌液PCR 检测，挑取阳性克隆。将含有目的片段的阳性菌落交由北京睿博兴科生物技术有限公司(青岛区)进行测序(王双艳等, 2019)。

鞍带石斑鱼isg15基因编码的氨基酸序列经BLAST 比对发现，与其他硬骨鱼类的isg15基因有较高的同源性，与斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的相似性为88.24%，与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)和条石鲷(Oplegnathus fasciatus)的相似性为61.18%、60.59%和60.00%，与爬行动物陆龟(Gopherus evgoodei)的相似性为33.53%，与2 种哺乳动物小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的相似性为32.94%和31.18% (表2)。

青海三江源、青海湖流域、祁连山等重大生态保护工程生态监测数据库框架已经搭建，积累了大量完整和连续的监测数据，但如何利用数据库开发提炼出具有参考价值的资料，还有待深入研究，并将研究成果及时提供给决策管理部门，使其真正为管理决策提供服务，所以加强生态监测数据库的研发应列入议事日程。

1.4 isg15 基因的序列分析及进化树的构建

利用在线软件ExPASy (http:www.au.expasy.org)对isg15基因的cDNA 序列进行蛋白翻译、分子量及等电点预测；使用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)预测保守结构域。在NCBI 上下载同源序列，利用 DNAman 进行同源序列比对分析(王杉等,2020)，利用 MEGA5.1 软件以邻位法(Neighborjoining, NJ)构建系统发育树。

使用qRT-PCR 检测健康的鞍带石斑鱼不同组织中的表达量；使用qRT-PCR 检测鞍带石斑鱼经过虹彩病毒感染刺激后5 个时间点的脾脏和肾脏的表达情况。根据isg15基因全长序列，设计qRT-PCR 正反向引物(isg15-RT-F/isg15-RT-R)(表1)，并以(ACTINRT-F/ACTIN-RT-R)(表1)作为内参基因。以鞍带石斑鱼在感染虹彩病毒后不同时间的脾脏和肾脏cDNA为模板，在 7500 Fast Real-time PCR 仪上进行qRT-PCR。20 μL 体系：10 μL SYBR，上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.8 μL，0.4 μL ROX reference dye Ⅱ，cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。每次反应均设阴性对照和无模板对照，每个反应设3 个重复。扩增程序：95℃5 min，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 个循环。所得实验数据采用相对CT 法(2-ΔΔCt)进行isg15基因mRNA 的表达量计算，实验得到的数据采用SPSS 软件进行方差分析，设定P＜0.05 为差异显著。

为研究isg15基因在健康鱼类中的表达模式，采用荧光定量PCR 技术检测isg15基因在鞍带石斑鱼健康个体的不同组织内基因相对表达水平变化。结果显示，isg15基因主要在血液中表达，肝脏、肾脏中的mRNA 水平较高，其次是鳃、肠、心脏、脾脏、皮肤、大脑和肌肉(图4)。

1.5 鞍带石斑鱼isg15 基因的表达模式检测

1992年，姜友善进入舒兰供销社农业生产资料有限公司工作。在同众多化肥生产厂家打交道的过程中，他与中阿撒可富结下了深厚的友谊。“为了让农民受益，我在选择合作厂家时，不看品牌的大小，只选择有良心的企业。”姜友善感慨说，“在舒兰，我和中阿撒可富是老相识，从开始干农资就一直保持着密切的合作。这么多年下来没有中断，凭的就是农民的认可和厂商间志同道合的相互信任。”

1.1.2 虹彩病毒感染及样品收集 将18 月龄的健

2 结果与分析

2.1 鞍带石斑鱼isg15 基因的克隆及序列分析

鞍带石斑鱼isg15基因序列全长为910 bp，其中，5′-非编码区为64 bp，开放阅读框为468 bp，3′-非编码区为378 bp，预测分子量为17.09 kDa，理论等电点为9.33(图1)。SMART 软件预测鞍带石斑鱼ISG15含有2 个类泛素结构域UBQ(ubiquitin-like domain)，分别在1～76 和86～156 位置，其中，C 端结构域含有泛素C 末端具有的LRLRGG 结构域(图1)。

图1 鞍带石斑鱼isg15 基因的cDNA 序列及其编码序列Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequences of E. lanceolatus isg15

2.2 isg15 基因多序列比对及系统进化树分析

1.3.2 5′RACE 和3′RACE 的克隆 根据克隆得到的isg15基因片段序列，分别设计5′RACE 和3'RACE的特异性扩增引物(5′-RACE-GSP/5′-RACE-NGSP 和3′-RACE-GSP/3′-RACE-NGSP)(表1)。分别以5′RACE cDNA 和 3′RACE cDNA 为模板进行 5′RACE 和3′RACE 扩增，第1 轮反应体系为10 μL，根据TaKaRaTaqTMHot Start Version 说明书介绍的体系比例加样混合，进行Touch down PCR 程序反应。第1 轮PCR 反应产物稀释50 倍作为第2 轮普通PCR 扩增反应的模板，反应体系为50 μL，同上按比例加样混合后进行PCR 反应，将得到的PCR 产物根据中间片段的克隆的验证方法处理并测序。

表2 鞍带石斑鱼和其他物种的ISG15 的氨基酸相似性Tab.2 Degree of homology similarity between ISG15 of E. lanceolatus and other vertebrates

使用DNAman 进行氨基酸多重序列比对，结果显示，不同物种间的ISG15 序列非常保守(图2)。为了确定isg15的系统进化关系，通过MEGA 5.1 软件，采用Neighbor-joining 法构建了脊椎动物isg15系统进化树(图3)。系统发育分析显示，9 种鱼类的isg15聚为一簇，爬行动物陆龟分为一支，2 种哺乳动物的isg15聚为一簇。

根据基因测序获得的isg15基因5′和3′及中间片段序列，利用DNAman 软件进行拼接，获得isg15基因全长序列。

图2 ISG15 的氨基酸序列多重序列比对结果Fig.2 The multiple sequence alignment of the ISG15 amino acid

图3 鞍带石斑鱼isg15 与其他物种isg15 系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of isg15 sequence of E. lanceolatus with other vertebrate isg15

2.3 鞍带石斑鱼isg15 基因在健康个体中的表达模式

阿东说：“他只有这点享受，我就要让他听。你拿给我，你不给我，我明天辞职，我带他到乡下去住。我到没有人的地方天天放给他听。”

图4 鞍带石斑鱼isg15 基因在不同组织的表达分布Fig.4 Expression profile of isg15 in different tissues of E. lanceolatus

2.4 注射虹彩病毒后isg15 基因在脾脏的表达模式

本研究采用荧光定量PCR 技术检测isg15基因在鱼体注射虹彩病毒的处理下，脾脏在不同时间(0、12、24、72 和96 h)基因相对表达水平变化。isg15基因在鱼体注射虹彩病毒后脾脏中相对表达变化的检测结果显示，与0 h 相比，各组脾脏内isg15基因的相对表达量在感染后72 h 显著上调至8.3 倍，在感染后96 h 降低为6.6 倍(图5)。

图5 虹彩病毒感染后鞍带石斑鱼isg15 基因在脾脏中的表达分布Fig.5 The expression of E. lanceolatus isg15 in spleen after iridovirus infection

2.5 注射虹彩病毒后isg15 基因在肾脏的表达模式

isg15基因在鱼体注射虹彩病毒后肾脏中相对表达变化的检测结果显示，isg15基因的相对表达量在肾脏中的表达变化更为剧烈，72 h 时其转录水平上调约11 倍，96 h 时下降至6.5 倍(图6)。

图6 虹彩病毒感染后鞍带石斑鱼isg15 基因在肾脏中的表达分布Fig.6 The expression of E. lanceolatus isg15 in kidney after iridovirus infection

3 讨论

本研究通过PCR 及RACE 方法成功获得了鞍带石斑鱼isg15基因cDNA 的全长序列。SMART 在线软件预测鞍带石斑鱼ISG15 含有2 个类泛素结构域UBQ，然而与泛素相比，ISG15 与目的蛋白结合并不会导致靶蛋白的降解，而是发挥生理信号功能，与基因转录调控、蛋白质翻译以及机体应激反应等生理过程有密切联系(Liuet al, 2014)。鞍带石斑鱼ISG15 的C 端结构域也含有泛素C 末端相同的LRLRGG 结构域，其对ISG15 与细胞内靶蛋白分子的连接极其重要(图1)。大多数泛素或类泛素样蛋白通过在LRLRGG结构域的末端加上几个氨基酸，从而使其处于失活状态，而类泛素样蛋白的活化则通过蛋白酶释放有活性的尾部(Daoet al, 2005)。isg15基因是ISGs 家族的重要成员之一，各个物种中的isg15基因均具有一定的保守性和保守功能(Morenoet al, 2018)。序列分析显示，克隆获得的鞍带石斑鱼isg15与斜带石斑鱼上的isg15相似度最高，达到88.24%，与大菱鲆、大黄鱼和条石鲷的相似性高于60%，与哺乳动物人和小鼠的相似性高于30%(图2)，这说明了亲缘关系越相近的物种，同源性越高。鞍带石斑鱼和其他几种已报道的鱼类，如斜带石斑鱼、条石鲷、棘鲷等的ISG15 蛋白C 端LRLRGG 结构域之后没有末端氨基酸，说明其处于天然活化状态，推测鞍带石斑鱼的ISG15 具有天然的抗病毒作用。

在测量小直径(激光测径仪量程范围内<25mm)和大直径(>25mm)的塞规由于测量原理不同，所引入的误差并不相同，因此应该分别进行分析。对于小直径的塞规尺寸测量引入的误差包括激光测径仪的测量误差u1为0.5μm；两顶尖的同轴度误差会使安装的塞规产生倾斜，导致测量的直径产生偏差λ，其中 λ=d(1/cosθ-1)，θ=arctan(l/L)，l为塞规在竖直方向的倾斜，L为塞规全长。当l取极大值5μm时，λ非常小，可以忽略；嵌入式软件对测量数据的处理结果对实际正确结果的偏差值服从正态分布，且其方差为0.001 4μm，这里根据拉依达准则取测量系统[10]的不确定度u2为0.004 2μm。

最初研究证明，鱼类中的I 型IFN 具有抗病毒活性，对包括斑马鱼(Danio rerio)中的蛇头横纹肌病毒(Altmannet al, 2003)、鲑中的传染性胰腺疾病(IPNV)(Robertsenet al, 2003)和斜带石斑鱼中的神经坏死病毒(NNV) (Ohtaet al, 2011)都有抑制作用。后期研究发现，IFN 还能够诱导ISG15 的表达。ISG15 通过与JAK1 和STAT1 等重要干扰素信号通路成员的结合，调控细胞对干扰素信号的反应(Malakhovet al,2003)。最新研究证明，isg15具有直接的抗病毒能力，其中，Wang 等(2012)研究发现，半滑舌鳎的isg15基因具有非结合形式的抗病毒能力；Langevin 等(2013)研究发现，斑马鱼isg15在EPC 细胞中过表达后能够抑制虹彩病毒等病毒的感染。因此，isg15是抗病毒防御体系的重要部分，可以在动物机体抗病毒方面发挥重要作用，但isg15在石斑鱼类抗病毒反应中的作用机制和调控通路需要进一步研究。

本研究对isg15基因在健康鞍带石斑鱼各个组织中的表达模式进行了探究，发现isg15基因在鞍带石斑鱼的各个组织中均有表达，在血液中表达量最高，在肝脏、肾脏中的表达水平较高，说明isg15主要在免疫组织中表达。鱼类免疫相关的基因在血液中表达较高的现象也早有报道，如牙鲆的efhd2和tbcld25基因在血液中表达量最高(侯吉伦等, 2019)。血液也是鱼体重要的免疫器官，是各类免疫细胞和免疫因子的天然携带者，在鱼体免疫应答过程中发挥重要的生理和生化作用。血液也是鱼体内各个器官间物质运输的载体，机体受到感染时，血液中的细胞因子能够快速到达病区。因此，推测在病毒感染后，鞍带石斑鱼isg15基因在血液中快速表达，随着血液流动运输到病毒攻击的部位，发挥抗病毒的免疫作用。本研究对虹彩病毒感染后鞍带石斑鱼isg15的表达变化检测发现，在脾脏和肾脏中，isg15的相对表达量呈现先升高后下降的趋势，在感染虹彩病毒72 h 出现峰值，其中，在脾脏中升高了8 倍，在肾脏中升高了近11倍，说明鞍带石斑鱼isg15基因在对抗虹彩病毒感染的过程中响应快速，在脾脏和肾脏中发挥着重要的防御作用。

综上所述，本研究首次对鞍带石斑鱼isg15基因进行了cDNA 全长克隆、进化分析及表达模式研究，同时，证明isg15基因在鱼体血液中的相对表达量远高于其他内脏组织，在脾脏和肾脏中发挥着防御病毒的作用，可为进一步研究isg15在抗病分子育种中的作用机制提供理论基础。