广佛手UDP-鼠李糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

周良云，蔡启忠，刘长征，刘 露，张春荣，杨 全

广佛手UDP-鼠李糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

周良云，蔡启忠，刘长征，刘 露，张春荣，杨 全*

广东药科大学中药学院 国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室国家中药材产业技术体系 广州综合试验站，广东 广州 510006

对广佛手var.中参与合成UDP-鼠李糖的UDP-鼠李糖合成酶（UDP-rhamnose synthase，RHM）基因进行全长cDNA克隆、功能鉴定及差异表达分析。基于广佛手转录组数据，筛选和克隆广佛手鼠李糖合成酶基因（）的全长cDNA，并对其进行生物信息学分析；构建原核表达载体，通过体外酶促反应鉴定CmRHM1的功能；利用实时荧光定量PCR分析广佛手不同器官中基因的表达特性。基因的开放阅读框（ORF）长度为2007 bp，编码668个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为75 330、理论等电点是6.97，为亲水蛋白，无信号肽。多重序列比对显示CmRHM1在序列的N-端和C-端均含有高度保守的2个结构域（GxxGxxG/A和YxxxK）。体外酶促反应结果表明CmRHM1蛋白具有催化UDP-Glc合成UDP-Rha的功能。实时荧光定量结果显示该基因在广佛手的茎、叶和果实中的表达水平依次为叶＞果实＞茎。基因的功能鉴定为UDP-鼠李糖及鼠李糖糖苷的生物合成奠定了物质基础。

佛手；UDP-鼠李糖合成酶；UDP-鼠李糖；基因克隆；功能鉴定

UDP-鼠李糖（UDP-Rha）是合成植物细胞壁主要成分鼠李半乳糖醛酸聚糖-I（rhamnogalacturonan- I，RG-I）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-II（rhamnogalacturonan-II，RG-II）以及各种鼠李糖糖苷类次生代谢产物所必需的重要组分之一[1]。RG-I、RG-II和半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）是植物细胞壁中主要的3种果胶多糖，它们在维管植物的生长和发育过程中承担着重要的作用。UDP-Rha常作为糖基供体参与黄酮、三萜、酚类等受体分子的糖基化反应，最终形成鼠李糖糖苷类次生代谢产物。研究显示，鼠李糖糖苷类化合物具有抗炎[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]和抗癌[5]等广泛的生理活性。在自然界中，鼠李糖至少有2种活化形式：dTDP-Rha和UDP-Rha[6-7]。dTDP-Rha主要分布在细菌中，而UDP-Rha则分布在真菌和植物中。在细菌中，dTDP-葡萄糖（dTDP-Glc）经dTDP-葡萄糖-4, 6-脱水酶（RmlB）、dTDP-4-酮-6-脱氧--葡萄糖-3，5-差向异构酶（RmlC）和dTDP-4-酮--鼠李糖-4-酮-还原酶（RmlD）3种酶连续催化生成dTDP-Rha[8-10]。在真菌中，由UDP-葡萄糖-4,6-脱水酶（UG4,6-Dh）和UDP-4-酮-6-脱氧-葡萄糖（UDP-4K6DG）-3,5-差向异构酶/-4-还原酶2种酶通过连续2步催化反应将UDP-葡糖糖（UDP-Glc）转化生成UDP-Rha[11]。在植物中，胞浆中的UDP-Glc在UDP-鼠李糖合成酶（RHM）的作用下一步生成UDP-Rha，该酶具备UG4,6-Dh、UDP-4K6DG-3,5-差向异构酶和UDP-4KR-4-酮-还原酶3种酶的功能[12]。目前，已从拟南芥[12]、杨树[13]、玉米[14]等植物中克隆鉴定出相应的RHM基因，而对药用植物中的RHM基因研究相对较少[15]。

佛手为芸香科柑橘属植物佛手L. var.Swingle的干燥果实，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰之功效，用于治疗肝胃气滞、胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐、咳嗽痰多等病症[16]。佛手主产于广东、广西、四川、福建、浙江等省，产于广东和广西的佛手称为“广佛手”。一般认为产于广东肇庆的广佛手质量最优，为道地药材[17]。本研究基于广佛手转录组数据，首先克隆得到1条广佛手RHM基因（）的全长cDNA序列，并通过原核表达获得重组蛋白。以槲皮素为底物、UDP-Glc为糖供体，和拟南芥UGT78D1 2种粗酶混合液为催化反应的酶进行体外酶促反应，通过检测槲皮素-3--鼠李糖苷的生成，以鉴定CmRHM的体外功能。其次，利用qRT-PCR检测在广佛手不同器官的表达水平。基因的功能鉴定为UDP-Rha及鼠李糖糖苷的生物合成奠定了基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

样品采自于肇庆市德庆县武垄镇云楼村（N23°20′2″，E112°14′16″，海拔60 m)，经广东药科大学杨全教授鉴定为芸香科植物佛手L. var.Swingle，剪取茎、叶和果实3个器官用液氮速冻后置−80 ℃保存备用。

1.2 仪器

高通量冷冻研磨仪，PowerPacTMBasic 型电泳仪，Tocan240型凝胶成像仪，Nano-100型微量分光光度计，C1000 TouchTMThermal Cycler 型PCR 仪，CFX96TMOptics Module型Real-time PCR仪，Waters高效液相色谱仪。

2 方法

2.1 CmRHM的克隆

从−80 ℃冰箱中取出广佛手样品置入EP管中并加入磁珠，用高通量冷冻研磨仪低温粉碎。总RNA的提取参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）说明操作。使用Takara公司的反转录试剂盒（PrimeScript ™ RT reagent Kit with gDNA Eraser）进行反转录，生成单链cDNA。根据从广佛手转录组数据中筛选的基因序列，设计cDNA全长克隆引物（引物序列见表1）。根据KOD-Plus-Neo高保真酶说明书配制PCR体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，正反向引物各2.5 μL，cDNA 1 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，ddH2O补足至50 μL。反应程序：94 ℃、2 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，重复35个循环；72 ℃、10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用TaKaRa胶回收试剂盒回收PCR产物。采用无缝克隆试剂盒（TransGen Biotech，中国），将PCR产物与经BamH I酶切后的pET-28a载体连接，并转化至大肠杆菌1-T1克隆感受态细胞中，涂布在含有50 mg/L Kan的LB固体培养基上过夜培养，选取单克隆进行菌液PCR验证，并将阳性结果送擎科公司测序验证。

表1 引物名称及序列

2.2 生物信息学分析

将测序得到序列通过ExPASy ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）预测蛋白相对分子质量和理论等电点；InterPro在线软件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan）进行结构域分析，PredictProtein （https://www.predictprotein. org/）进行二级结构预测和二级结构分析；SignalP 4.1 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽分析；TRMHMM server v2.0 （http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进行跨膜域分析；根据NCBI BLAST结果下载同源序列，分别使用DNAMAN软件和MEGA 5.0软件进行多重序列比对和系统进化树的构建。

2.3 CmRHM蛋白体外诱导表达

挑选测序验证后的菌液，过夜培养，提取pET-28a-CmRHM重组质粒，转化到Transetta（DE3）感受态大肠杆菌中培养。挑取阳性克隆进行PCR检测，并送测序验证表达系统正确性。挑选序列正确菌株扩大培养于100 mL含有50 mg/LKan的LB液体培养基中，37 ℃ 250 r/min振荡培养至600 nm处吸光度（600）值达0.6～1.0，加入IPTG至终浓度0.4 mmol/L，16 ℃、200 r/min诱导培养过夜。将诱导完的菌液4 ℃、5000×离心10 min，收集菌体。用预冷的ddH2O清洗菌液2次，菌体悬浮于缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、10%甘油、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟）中，超声波细胞破碎机超声破碎（30%功率，超声5 s，间隔5 s，持续5 min）。破碎后4 ℃、13 000 r/min离心15 min，上清即为蛋白粗提物。取蛋白粗提物加入6×loading buffer混匀，沸水浴5～10 min、12 000×离心5 min，上样10 μL进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将胶置于考马斯亮蓝染色1 h，用脱色液进行背景脱色，检测蛋白表达情况。

2.4 AtUGT78D1表达载体的构建及原核表达

从NCBI网站下载拟南芥基因序列，提交给苏州泓迅生物科技有限公司合成并连接到pET-28a载体上，构建重组表达载体。将克隆菌株扩大培养，提取重组质粒，转化到Transetta（DE3）中培养，挑选阳性克隆菌，按“2.3”项下的操作进行AtUGT78D1重组蛋白的体外表达及蛋白提取。

2.5 体外酶促反应与检测

2.5.1 阴性对照品溶液的制备 酶促反应体系总体积为400 μL：含0.5 mmol/L UDP-Glc、0.1 mmol/L槲皮素、0.5 mmol/L NADPH、0.5 mmol/L NAD+以及AtUGT78D1和CmRHM粗酶液各193 μL。以空载表达菌在同等条件下诱导的蛋白粗提物替代CmRHM粗酶液进行酶促反应为阴性对照。

2.5.2 供试品溶液的制备 将酶促反应体系在30 ℃水浴锅中反应过夜，加入400 μL甲醇终止反应，振摇混匀，14000×离心20 min，取上清过0.22 μm滤膜，得到供试品溶液。

2.5.3 对照品溶液的制备 精密称取12.09 mg槲皮素，18.58 mg槲皮素-3--葡萄糖，17.93 mg槲皮素-3--鼠李糖苷分别加入1 mL DMSO溶解，制得各对照品浓度为40 mmol/L的母液。吸取母液各2 μL，并补足甲醇至800 μL，过0.22 μm滤膜，得到浓度为0.1 mol/mL的槲皮素、槲皮素3--葡萄糖苷、槲皮素3--鼠李糖苷混合对照品溶液。

2.5.4 色谱条件 色谱柱为Waters Symmetry C18Column（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Waters公司），柱温30 ℃。流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（55∶45），体积流量1 mL/min，进样量10 μL，检测波长为366 nm。

2.6 不同器官CmRHM基因的差异表达分析

利用实时荧光定量检测基因在不同组织中的表达水平。冰上配制反应体系20 μL；包含10 μL TBGreen Premix Ex Taq II（2×）、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL、2 μL cDNA、6.4 μL ddH2O，在CFX96 Touch （Bio-Rad，美国）仪上进行扩增。PCR反应条件：预变性（95 ℃、30 s）；变性（95 ℃、5 s），退火和延伸（60 ℃、30 s）40个循环；最后添加熔解曲线设置。相对定量分析采用2−ΔΔCt方法进行计算，结果采用GraphPadPrism 7.0进行数据分析与绘图。

3 结果与分析

3.1 CmRHM基因全长克隆

以广佛手cDNA为模板进行全长克隆，获得1条基因的PCR产物约为2000 bp，与预期大小相近，如图1所示。将PCR产物经纯化后连接到pET-28a载体上并转化到大肠杆菌中，选择阳性克隆菌株送测序公司进行测序。测序结果显示克隆获得的序列长度为2007 bp，与转录组数据中的序列一致。该基因编码668个氨基酸，命名为

3.2 CmRHM1基因序列的生物信息学分析

CmRHM1蛋白的相对分子质量为75 330、理论等电点为6.97，为亲水蛋白。信号肽分析显示无信号肽；跨膜域分析结果表明CmRHM1蛋白为非跨膜蛋白。结构域分析表明：CmRHM1在10～315 aa处含有NADP（H）结合位点；在384～557 aa处含有类似RmlD酶结构的活性中心。二级结构预测结果显示：基因编码蛋白的二级结构中无规则卷曲占58.08%，α-螺旋结构占29.19%，其中无规则卷曲和α-螺旋结构是其主要的结构原件。

M-Marker 1-PCR扩增产物

3.3 CmRHM1氨基酸序列和系统进化树分析

BLAST结果显示，CmRHM1氨基酸序列与甜橙(L.) Osbeck，阿月浑子L.、川桑Schneid.、木槿L.等7种植物的相似度均达到80%以上。利用DNAMAN软件将其与同源性较高的植物进行氨基酸序列多重比对（图2），结果显示CmRHM1氨基酸序列存在NADP(H)结合位点（GXXGXXG/A）和类似RmlD酶结构的活性中心（YXXXK）。结合InterProScan结构域分析，CmRHM1蛋白具有2个功能不同的结构域：具有UG4,6-Dh活性的N末端域和具有UDP-4K6DG-3,5-差向异构酶和UDP-4KR 4-酮-还原酶双功能活性的C-端区域[18]（UERs）。为了进一步研究CmRHM1蛋白的功能，在NCBI中下载完整RHM酶的氨基酸序列和UDP-4K6DG 3,5-差向异构酶和UDP-4KR 4-酮-还原酶双功能的酶，利用MEGA 6.0软件构建系统进化树（图3）。结果发现CmRHM1与甜橙的亲缘关系最近，与拟南芥(L.) Heynh.、陆地棉L.等植物的亲缘关系较远。

图2 CmRHM1序列与其他植物多重序列比对

图3 CmRHM1系统进化分析

3.4 CmRHM1与AtUGT78D1的原核表达分析

分别构建pET-28a-CmRHM1和pET-28a- AtUGT78D1重组表达载体，并转化到Transetta（DE3）感受态中进行异源表达。SDS-PAGE电泳结果显示：与空载相比，pET-28a-CmRHM1和pET-28a-AtUGT78D1在近70 000和55 000处出现目的蛋白条带，分别与CmRHM1和AtUGT78D1预测的蛋白大小基本一致（图4）。所以这2个蛋白条带为诱导表达的CmRHM1重组蛋白和AtUGT78D1重组蛋白。

M-Marker 1-空载 2-CmRHM1重组蛋白 3-AtUGT78D1重组蛋白

3.5 CmRHM1的体外催化功能

AtUGT78D1蛋白既能将UDP-Glc作为供体对槲皮素进行糖基化生成槲皮素-3--葡萄糖苷，又能将UDP-Rha作为供体对槲皮素进行鼠糖基化生成槲皮素-3--鼠李糖苷。利用AtUGT78D1蛋白的双重糖基化功能，对CmRHM1的生物活性进行体外验证。以槲皮素为底物，UDP-Glc为糖供体，在酶促反应体系中加入重组蛋糖苷产物类型来考察CmRHM1的功能。其中不添CmRHM1的为对照组，添加重组蛋白CmRHM1的为实验组。结果显示（图5），对照组的酶促反应体系在保留时间4.03 min处出现明显的色谱峰，这与标准品槲皮素-3--葡萄糖苷（S1）的出峰时间相近，说明体系中有槲皮素-3--葡萄糖苷的生成；实验组的酶促反应体系仅在4.95 min处出现明显的色谱峰，这与槲皮素-3--鼠李糖苷（S2）的出峰时间一致，说明加入重组CmRHM1蛋白的酶促反应体系中有UDP-Rha的生成，AtUGT78D1利用体系生成的UDP-Rha作为供体对槲皮素鼠李糖基化生成槲皮素-3--鼠李糖苷。在本实验中，2组酶促反应体系均未在8.38 min（S3）处出现色谱峰，说明底物槲皮素均被转化成相应的糖苷。实验结果证明，CmRHM1在体外具有将UDP-Glc转化成UDP-Rha的功能。

S1-槲皮素-3-O-葡萄糖苷 S2-槲皮素-3-O-鼠李糖苷 S3-槲皮素

3.6 不同器官CmRHM1基因差异表达分析

利用qRT-PCR对广佛手不同器官（茎、叶、果实）中的基因进行差异表达分析，结果显示（图6），基因在叶中的表达量最高，而在茎中的表达量最低。相对于茎而言，叶中基因的相对表达水平为4.03（＜0.001），果实中基因的相对表达水平为1.36。

***表示差异显著，P＜0.001

4 讨论

UDP-Rha是生物合成多糖和鼠李糖糖苷类天然产物的必要组分之一。然而，在植物中，分离并鉴定出与UDP-Rha合成相关的基因依然很少。目前，尚未有广佛手中关于基因的相关报道，本实验基于转录组数据首次从广佛手中扩增得到1条基因全长序列，并对其进行了生物信息学的分析。多重序列比对分析显示在序列的N-端和C-端均含有植物RHM中高度保守的2个结构域（GxxGxxG/A和YxxxK），GxxGxxG/A是酶促反应辅因子NADP(H)结合位点，而辅因子NAD+则结合YxxxK结构，暗示着具有将UDP-Glc转化成UDP-Rha的能力。进化分析显示与同属植物甜橙的亲缘关系最近，而与拟南芥等植物的亲缘关系相对较远。此外，本研究通过构建表达载体pET-28a-CmRHM1并诱导其重组蛋白的表达，并结合拟南芥AtUGT78D1具有鼠李糖基化槲皮素生成槲皮素3--鼠李糖苷的功能对广佛手的功能进行鉴定，进一步证实了CmRHM1蛋白具有催化UDP-Glc合成UDP-Rha的功能。为了考察不同器官中基因的表达情况，本研究利用qRT-PCR的方法对基因在广佛手的茎、叶和果实进行了差异表达分析，结果显示基因在茎、叶和果实中的表达水平依次为叶＞果实＞茎。

迄今为止，在代谢工程或合成生物学中用于微生物合成UDP-Rha的基因主要为拟南芥的2和1[1,19]。本实验从药用植物广佛手中获得了1条能一步将UDP-Glc转化成UDP-Rha的鼠李糖合成酶基因，以期为微生物合成UDP-Rha提供候选基因，也为鼠李糖糖苷类次生代谢产物的合成提供物质基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] Kim B G, Kim H J, Ahn J H. Production of bioactive flavonol rhamnosides by expression of plant genes in[J]., 2012, 60(44): 11143-11148.

[2] Rho H S, Ghimeray A K, Yoo D S,. Kaempferol and kaempferol rhamnosides with depigmenting and anti-inflammatory properties [J]., 2011, 16(4): 3338-3344.

[3] Choi H J, Kim J H, Lee C H,. Antiviral activity of quercetin 7-rhamnoside against porcine epidemic diarrhea virus [J]., 2009, 81(1): 77-81.

[4] Hayder N, Bouhlel I, Skandrani I,.antioxidant and antigenotoxic potentials of myricetin-3--galactoside and myricetin-3-- rhamnoside from: Modulation of expression of genes involved in cell defence system using cDNA microarray [J]., 2008, 22(3): 567-581.

[5] Diantini A, Subarnas A, Lestari K,. Kaempferol-3--rhamnoside isolated from the leaves ofKorth. inhibits MCF-7 breast cancer cell proliferation through activation of the caspase cascade pathway [J]., 2012, 3(5): 1069-1072.

[6] Kamsteeg J, Van Brederode J, Van Nigtevecht G. The formation of UDP--rhamnose from UDP--glucose by an enzyme preparation of red((L) Clairv) leaves [J]., 1978, 91(2): 281-284.

[7] Jiang X M, Neal B, Santiago F,. Structure and sequence of the rfb (O antigen) gene cluster ofserovar typhimurium (strain LT2) [J]., 1991, 5(3): 695-713.

[8] Yoo H G, Kwon S Y, Karki S,. A new route to dTDP-6-deoxy-l-talose and dTDP--rhamnose: DTDP-- rhamnose 4-epimerase in[J]., 2011, 21(13): 3914-3917.

[9] Giraud M F, Leonard G A, Field R A,. RmlC, the third enzyme of dTDP--rhamnose pathway, is a new class of epimerase [J]., 2000, 7(5): 398-402.

[10] Blankenfeldt W, Kerr I D, Giraud M F,. Variation on a theme of SDR. dTDP-6-deoxy-L-lyxo-4-hexulose reductase (RmlD) shows a new Mg2+-dependent dimerization mode [J]., 2002, 10(6): 773-786.

[11] Martinez V, Ingwers M, Smith J,. Biosynthesis of UDP-4-keto-6-deoxyglucose and UDP-rhamnose in pathogenic fungiand[J]., 2012, 287(2): 879-892.

[12] Oka T, Nemoto T, Jigami Y. Functional analysis ofRHM2/MUM4, a multidomain protein involved in UDP--glucose to UDP--rhamnose conversion [J]., 2007, 282(8): 5389-5403.

[13] Kim B G, Jung W D, Ahn J H. Cloning and characterization of a putative UDP-rhamnose synthase 1 fromGuinier [J]., 2013, 56(1): 7-12.

[14] Casas M I, Falcone-Ferreyra M L, Jiang N,. Identification and characterization of maize salmon silks genes involved in insecticidal maysin biosynthesis [J]., 2016, 28(6): 1297-1309.

[15] 刘露, 周良云, 张春荣, 等. 何首乌中UDP-鼠李糖合成酶基因FmRHM1/2的克隆与鉴定 [J]. 药学学报, 2019, 54(8): 1515-1523.

[16] 中国药典 [S]. 一部. 2015: 178.

[17] 袁旭江, 林励. 中药佛手不同品种间的研究及其存在问题 [J]. 广州中医药大学学报, 2002, 19(1): 73-76.

[18] Yin S, Liu M, Kong J Q. Functional analyses of OcRhS1and OcUER1 involved in UDP--rhamnose biosynthesis in[J]., 2016, 109: 536-548.

[19] Roepke J, Bozzo G G. Biocatalytic synthesis of quercetin 3--glucoside-7--rhamnoside by metabolic engineering of[J]., 2013, 14(18): 2418-2422.

Cloning and characterization of a UDP-rhamnose synthase gene from

ZHOU Liang-yun, CAI Qi-zhong, LIU Chang-zheng, LIU Lu, ZHANG Chun-rong, YANG Quan

School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University/ Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Production & Development of Cantonese Medicinal Materials/ Comprehensive Experimental Station of Guang zhou, Chinese Materia Medica, China Agriculture Research System, Guangzhou 510006, China

To clone and characterize a UDP-rhamnose synthase gene involved in the biosynthetic mechanism of UDP-rhamnose for the medicinal plant.Based on the transcriptome data, the full-length cDNA of UDP-rhamnose synthase gene () was screened and cloned, and then the bioinformatics analysis was carried out. The prokaryotic expression vector was constructed and the function of CmRHM1was identified by enzymatic reaction. Additionally, Real-time PCR was performed to analyze the expressive characteristics of CmRHM1 gene in different plant organs.The ORF length ofwas 2007 bp, encoding 668 aa. Bioinformatic analysis of the amino acid sequence showed that the molecular weight of encoded protein was 75 330, and theoretical isoelectric point was 6.97. This protein was proved to be a hydrophilic protein without signal peptide sequence. Multiple sequence alignment showed thatcontained two highly conserved domains (GxxGxxG/A and YxxxK) at the-terminal and-terminal regions. The enzymatic reactionrevealed that CmRHM1 has indeed been shown to have catalytic activities for converting UDP-glucose into UDP- rhamnose. The results of qPCR showed that the ranking of the expressive level of thein the stem, leaf and fruit was leaf > fruit > stem.The functional identification ofgene reported here provides the basic foundation for the biosynthesis of UDP-rhamnose and rhamnosides.

L. var.Swingle; UDP rhamnose synthase; UDP-rhamnose; cloning; characterization

R282.12

A

0253 - 2670(2021)16 - 5005 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.025

2021-02-13

国家重点研发计划（2017YFC1700704）；2017年广东省岭南中药材保护资金专项（粤财社[2017]60号）；广东省普通高校青年创新人才类项目（2018KQNCX133）

周良云（1986—），男，讲师。Tel: 18810599924 E-mail: 503712735@qq.com

杨 全，教授。Tel: (020)39252353 E-mail: yangquan7208@vip.163.com

[责任编辑 时圣明]