参虎败毒颗粒体内抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果观察

李 晨，邱存义，冯逸雪，韩力康，杜连昭，王茜茜，马 欣，李瑞香*，王兴龙*

(1. 西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100； 2. 渭南市临渭区动物疫控中心，渭南 714000； 3. 浙江金大康动物保健品有限公司，金华 321016)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染猪后引起的一种严重危害养猪业的传染病。PRRSV造成以流产、早产、产死胎或木乃伊胎为特征的母猪繁殖障碍性疾病和仔猪、育肥猪呼吸系统疾病。1996 年，我国首次分离到该毒株，正式确定了PRRS 在我国的传播[1-2]。2006 年暴发的高致病性蓝耳病(HP-PRRS)，其致病性相对经典PRRSV 有了显著升高[3]，近年来，国内又在流行类NADC-30毒株，给防控带来巨大压力[4]。PRRSV有两种基因型，PRRSV-I型(Lelysted virus，LV)为欧洲型毒株，PRRSV-II型(VR-2332)为美洲型毒株[5-6]。虽然欧洲型和美洲型毒株感染猪后引起的临床症状相似，但二者抗原性差异较大，核苷酸相似度为55%～70%，氨基酸相似度为50%～80%[7-9]。目前，生产上主要用弱毒活疫苗或灭活疫苗预防PRRS，多数情况下免疫无法为野毒株提供充分保护，弱毒活疫苗还存在返强风险[10-11]。积极寻求PRRS新的防控方案是近年来动物疫病防控领域研究的热点。许多研究发现，中药及其多糖类化合物具有很好的抗病毒效果[12]，参虎败毒颗粒是由黄芩、虎杖、白头翁、苦参、板蓝根等中药组成，具有清热解毒、扶正祛邪、利湿退黄、抗菌抗病毒作用[13]，推测参虎败毒颗粒可能对PRRSV具有较好抑制效果。因此，有必要对参虎败毒颗粒抗PRRSV的作用进行研究，为其临床应用和后期高效抗PRRSV复方中药的开发寻找依据。

1 材料与方法

1.1 中药及试剂

参虎败毒颗粒复方中药由浙江金大康动物保健品有限公司提供；反转录试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测试剂盒购自北京金诺百泰生物技术有限公司。

1.2 毒株及试验动物

PRRSV JXA1毒株(104.7TCID50·mL-1)由西北农林科技大学兽医传染病实验室提供，动物选用20头35日龄健康、体重相近的PRRSV病原、抗体阴性断奶仔猪，由勉县良种繁育场提供。

1.3 PRRSV检测引物

根据GenBank发表的序列，设计针对PRRSV ORF6、ORF7和猪β-actin片段引物及探针，PRRSV ORF6与探针检测病毒血症，PRRSV ORF7与β-actin检测组织病毒载量(表1)。

表1 PCR引物和探针序列

1.4 方法

1.4.1 试验动物分组与处理 将20头仔猪随机平均分为A、B、C、D共4个组。A组仔猪接种PRRSV前3 d饲料中添加药物；B组接种PRRSV当天饲料中添加药物；C组仔猪只接种PRRSV不添加药物；D组仔猪为阴性对照组，各组单独饲养管理。A、B、C组仔猪在试验第3天肌肉注射PRRSV JXA1毒株2.0 mL。

每日观察各组仔猪临床症状并测定体温，攻毒后14 d各组随机选取1头仔猪处死，进行眼观肺部病理变化检查和组织病理学检查，并检测肺的病毒载量。攻毒后1、3、5、7、14、21、28、35 d采抗凝和非抗凝血，进行PRRSV抗体和病毒血症检测。动物分组及处理方案见表2。

表2 试验动物分组及处理方案

1.4.2 病理组织切片制作 肺组织样品经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后，制作组织切片并进行HE染色[14]，显微镜下观察组织病理变化并拍照。

1.5 统计分析

用SPSS 20.0软件对各组数据进行统计分析，以邓肯氏法进行多重比较，P<0.01表示差异极显著(**)，P<0.05表示差异显著(*)，P>0.05表示差异不显著。

1.6 动物使用伦理

遵照《陕西省实验动物管理办法》(陕西省人民政府令 第150号)和西北农林科技大学实验动物管理处置办法进行实验动物操作，符合动物福利要求。

2 结 果

2.1 仔猪体温变化

A、B组攻毒后第6天体温升高至40 ℃，持续至第11和12天恢复正常，高热分别持续5和6 d；C组攻毒后第5天体温升高至40 ℃，持续至第14天，高热持续时间超过9 d；D组仔猪体温正常(图1)。

图1 仔猪直肠温度变化Fig.1 Rectal temperature changes in piglets

2.2 仔猪肺组织眼观病理变化

攻毒14 d，各组随机选1头仔猪处死，眼观病变主要集中在肺部，A组仔猪肺略显苍白，边缘有少许实病，肺叶轻度皱缩(图2a)。B组仔猪肺暗红色，有部分出血点，边缘及肺叶出血，小面积实变，肺叶少许皱缩(图2b)。C组仔猪肺颜色更深，实变更为明显，肺表面有出血点，出现明显皱缩和凹凸不平(图2c)。D组仔猪肺粉红色、饱满、无皱缩(图2d)。

a. A组仔猪肺；b. B组仔猪肺；c. C组仔猪肺；d. D组仔猪肺a. Lung from the piglet in group A; b. Lung from the piglet in group B; c. Lung from the piglet in group C; d. Lung from the piglet in group D 图2 各组仔猪肺组织眼观病理变化Fig.2 Gross lesions in lungs from the piglets in different groups

2.3 仔猪肺组织病理学变化

分别在10倍物镜下观察仔猪肺泡腔和肺泡壁(图3a～d)；在40倍物镜下观察仔猪支气管管腔及官腔周围淋巴细胞浸润情况(图3e～h)。A组可观察到少量肺泡结构破坏，肺泡壁稍增厚(图3a)；支气管上皮细胞肿大、增生，管腔内有炎性渗出物和脱落的细胞以及少量巨噬细胞，细支气管周围大量有淋巴细胞和巨噬细胞浸润(图3e)。B组少量肺泡结构破坏，肺泡壁增厚，厚薄不均匀(图3b)；支气管上皮细胞肿大、增生，管腔内有炎性渗出物和脱落的细胞以及少量巨噬细胞，细支气管周围有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润(图3f)。C组肺泡结构大量破坏，肺泡壁有大量淋巴细胞浸润，肺泡壁增厚导致肺泡狭窄(图3c)；支气管上皮细胞肿大、增生，管腔内有炎性渗出物和脱落的细胞以及大量巨噬细胞，细支气管周围有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润(图3g)。D组肺泡结构清晰，无明显病变(图3d)；支气管上皮细胞无明显病变，管腔内无渗出物(图3h)。

a、e. A组仔猪肺组织病理学变化；b、f. B组仔猪肺组织病理学变化；c、g. C组仔猪肺组织病理学变化；d、h. D组仔猪肺组织病理学变化a, e. Micro-lesions in lungs from piglet in group A; b, f. Micro-lesions in lungs from piglet in group B; c, g. Micro-lesions in lungs from piglet in group C; d, h. Micro-lesions in lung from piglets in group D图3 各组仔猪肺组织病理学变化Fig.3 Micro-lesions in lungs from piglets in each group

2.4 仔猪脾和淋巴结组织病理变化

为观察参虎败毒颗粒组织毒性和PRRSV对免疫器官的影响，取各组仔猪脾和淋巴结制作组织病理学切片。其中A组连续用药17 d，B组连续用药14 d。结果发现，各组脾和淋巴结组织结构未受到明显影响，各组脾组织中脾小结结构清晰，无明显病变(图4a～d)；各组淋巴结无明显病变，生发中心结构清晰，淋巴细胞数量没有明显变化(图4e～h)。

a～d. A～D组仔猪脾组织病理学变化；e～h. A～D组仔猪淋巴结组织病理学变化a-d. Micro-lesions in spleens of the piglets from Group A-D; e-h. Micro-lesions in lymph nodes of the piglets from Group A-D图4 各组仔猪脾和淋巴结组织病理学变化(10×)Fig.4 Micro-lesions in spleens and lymph nodes of the piglets from different groups (10×)

2.5 仔猪血液中PRRSV载量

RT-qPCR检测攻毒后1、3、5、7、14、21和28 d仔猪全血样品，当Ct > 35时判定为阴性，A组仔猪21 d PRRSV检出比例为2/4，28 d 降为0/4；B组仔猪21 d 检出比例为4/4，28 d降为0/4；C组仔猪21 d 检出比例为4/4，28 d降为3/4；D组全程检出比例均为0/4 (表3)。

A、B组部分猪在21和28 d 时PRRSV检测为阴性，因此，仅对1、3、5、7和14 d仔猪全血病毒载量进行定量分析。结果如图5所示，A、B、C组仔猪病毒载量均在第5天达到峰值，随后逐渐下降。A组在攻毒后第3、5、7、14天病毒载量均极显著低于C组(P<0.01)。B组在攻毒后第3和5天病毒载量极显著低于C组(P<0.01)，在攻毒后第7和14天病毒载量显著低于C组(P<0.05)。

表3 仔猪血液中PRRSV检出比例

a. 仔猪PRRSV病毒载量；b. RT-qPCR标准曲线(y=-3.195x+39.801，R2=0.998)。ns表示差异不显著，下同a.PRRSV viral load in piglets; b. Standard curve of RT-qPCR (y=-3.195x+39.801，R2=0.998). ns represents non-significant difference, same as below图5 RT-qPCR检测全血样品中PRRSV载量Fig.5 RT-qPCR analyze viral loads in blood samples

2.6 仔猪肺组织PRRSV载量

RT-qPCR检测攻毒后14 d A、B、C组仔猪肺组织PRRSV载量，β-actin为内参，将病毒载量最少的组作为参照。结果显示，C组病毒载量显著高于A组(P<0.05)， A、B组差异不明显(P>0.05，图6)。

2.7 仔猪PRRSV抗体产生情况

A、B、C组仔猪PRRSV抗体均在第14天转阳，A、B组在第21天抗体S/P值达到峰值，随后下降(图7a、b)，C组在攻毒后28 d抗体S/P值达到峰值(图7c)。A组仔猪抗体(S/P平均值1.061)低于B组(S/P平均值1.913)和C组(S/P平均值1.744)(图7d)，但差异不显著，A组抗体离散度小于其他两组。

图6 各组仔猪肺组织PRRSV载量Fig.6 Viral loads in lungs from the piglets in different groups

a.A组抗体S/P值；b. B组抗体S/P值；c. C组抗体S/P值；d. 各组相对抗体S/P值a. S/P value of group A; b. S/P value of group B; c. S/P value of group C; d. Relative S/P value in each group图7 PRRSV抗体产生情况Fig.7 The production of PRRSV antibodies

3 讨 论

参虎败毒颗粒组方起源于古方七清败毒颗粒，主要成分为黄芩、虎杖、白头翁、苦参、板蓝根、大青叶和绵马贯众。黄芩具有清热燥湿，泻火解毒的作用，其多糖成分主要包括黄芩苷、黄芩素等[15]。黄芩苷与黄芩素均能不同程度地干扰和抑制病毒的复制增殖[16]，体外抗PRRSV中药单体筛选试验中，黄芩苷在最大安全浓度(18 μmol·L-1)时对PRRSV具有较好的抑制作用和直接杀灭作用，但在低浓度(9 μmol·L-1)时抗PRRSV作用不明显[17]，而以黄芩为主要成分的栀子四黄散饲喂感染PRRSV的猪，发现其具有减轻临床症状的作用，也可促进IgG、IFN-γ的产生和抑制IL-10的升高[18]。虎杖具有清热祛湿，退热止痛的作用，其主要活性成分包括白藜芦醇和大黄素等，白藜芦醇对许多DNA和RNA病毒具有抑制作用和免疫调节作用[19-20]，中药体外抗PRRSV结果发现，虎杖具有显著的抗PRRSV作用，其抑制率可达90%以上[21]。白头翁具有清热解毒，凉血止痢的作用，白头翁多糖成分主要为白头翁皂苷、白头翁素和三萜酸等[22]，体外抗PRRSV试验结果表明，白头翁粗提取物对PRRSV感染Marc-145细胞具有显著的抑制作用、直接杀灭作用和阻断作用[23]。苦参具有清热利湿，抗菌消炎的作用，苦参碱是其主要活性成分，有研究显示，苦参碱提前作用于Marc-145细胞后接毒可显著降低细胞CD163和CD151的表达，但单独使用苦参碱作用于细胞时不会抑制CD163和CD151的表达[24]，另有研究表明，苦参碱可能在细胞感染PRRSV后不同时间点抑制不同的细胞受体而发挥抗病毒作用[25]。板蓝根的功效是清热解毒、凉血止咳，其主要活性成分板蓝根多糖具有较好的抗病毒效果和免疫增强作用[26]，体外抗病毒试验结果表明，板蓝根多糖对PRRSV具有较强的阻断作用和抑制作用，但在低浓度时对PRRSV无直接杀灭作用[27-28]，另有研究表明，通过饲喂板蓝根提取物可显著抑制PRRSV弱毒疫苗免疫后猪体内病毒核酸载量，且病毒核酸载量在试验过程中呈下降趋势[29]。

本研究中，提前和感染同时药物处理的两组仔猪在攻毒后12 d体温恢复至正常，而无药物处理感染组体温在14 d仍高于40 ℃，并且肺部眼观和组织病理变化结果都显示，饲喂参虎败毒颗粒可显著减轻PRRSV对肺的损伤，该结果与解慧梅等[18]使用栀子四黄散治疗感染PRRSV仔猪的结果相似。药物处理可减轻PRRSV感染引起的临床症状，本试验中设置了提前药物处理组，结果显示，提前预防用药效果更好，提示中药制剂可能对PRRSV的预防作用强于治疗作用。饲喂参虎败毒颗粒的两组仔猪在攻毒后14 d内均可极显著或显著抑制猪体内PRRSV载量，促进PRRSV的清除，该结果和王惠[30]研究的板蓝根配合不同中药制剂可降低PRRSV载量结果一致，且提前预防用药效果优于接毒同时用药，这可能与仔猪感染PRRSV前含有一定的血药浓度有关。PRRSV抗体S/P值结果显示，3组仔猪血清PRRSV抗体阳性率均在攻毒后14 d达到100%，但饲喂参虎败毒颗粒的两组仔猪PRRSV抗体峰值提前，提前药物处理组抗体S/P值低于无药物处理感染组(病毒对照组)，与林昌华等[31-32]提前饲喂月桂酸降低PRRSV抗体水平的结果相似，不同的是，饲喂月桂酸后PRRSV抗体峰值与对照组保持一致，而本试验中饲喂参虎败毒颗粒后可使PRRSV抗体峰值提前，这可能与药物的免疫调节作用有关，需进一步研究。

JXA1毒株为高致病PRRSV毒株，但试验过程中未造成感染仔猪死亡，可能与接种剂量(2 mL×104.7TCID50·mL-1)偏少、病毒多次细胞传代(30代)导致毒力下降或试验仔猪日龄偏大有关(35日龄)，但攻毒仍然造成了明显的肺组织病理损伤，药物处理组和感染组存在明显的眼观和组织病理变化差异，可以证明药物确实能够抑制PRRSV的致病变作用，对试验预期效果影响不大。

4 结 论

综上所述，参虎败毒颗粒可显著减轻PRRSV感染造成的肺损伤、降低病毒血症、促进病毒清除，且预防性用药效果更好，提示参虎败毒颗粒可作为预防和治疗PRRSV的药物。另外，参虎败毒颗粒可以缩短PRRSV病毒血症持续时间，提示可以在接种PRRSV弱毒疫苗后使用，以减少疫苗毒猪体带毒时间，降低弱毒疫苗变异返强风险。本研究证明了参虎败毒颗粒具有很好的体内抗PRRSV的作用，为PRRSV临床防控用药提供了重要的理论支撑，同时为更加高效的抗PRRSV复方中药的研究提供参考数据。