CV-A5抗体制备及ELISA抗原检测方法的建立①

张小宇 靳卫平 王文辉 吴 杰 卢 佳 孟胜利 王泽鋆 申 硕

（武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室，国家联合疫苗工程技术研究中心，武汉430207）

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由人肠道病毒（human enterovirus，HEV）引起的婴幼儿感染为主的流行性传染病，在我国丙类传染病中发病率位居第一，主要症状包括患儿手、足、口腔等处皮肤疱疹、溃疡，并伴有发热、乏力和精神萎靡等全身症状，少数患者可出现严重中枢神经系统症状，严重危害婴幼儿健康和生命安全［1］。武汉生物制品研究所于2016～2017年在湖北省襄阳市进行的HFMD病原学研究表明，3 216例HFMD患儿临床样本中柯萨奇病毒A组5型（Coxsackievirus A5，CV-A5）感染呈高比例，且与CV-A2、CV-A6、CVA10、CV-A16和肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV-71）共同流行，是HFMD的主要病原体之一［2-5］。CVA5属小RNA病毒科肠道病毒属，呈20面体球形对称，为单股正链RNA，长度为7 400～7500 nt，编码多聚蛋白。基因组5΄末端至3΄末端依次排列5΄UTR，编码区为P1、P2、P3、3΄UTR及多聚腺苷酸尾。P1编码主要结构蛋白，终产物为VP1～VP4。VP1～VP3暴露于病毒粒子表面，VP4存在于病毒内部［6］。CV-A5与诺如病毒（norovirus，NoV）GⅡ.4共同感染可能诱发间歇性枫糖尿症（MSUD）6岁患儿首次严重急性脑病；CV-A5与乙型流感病毒共同感染可能引发瑞氏综合征，对肝脏和大脑产生巨大损伤，如不及时治疗将迅速导致肝肾衰竭、脑损伤，甚至死亡；CVA5原型株与EV-71重组可能导致HFMD暴发，并伴有严重神经系统症状［7-9］。研发包含CV-A5的HFMD多价疫苗，对预防和控制CV-A5及其他肠道病毒暴发及引发的重症具有重要意义。抗原检测是疫苗工艺稳定、质量可控的重要保证，是质控方法不可缺少的环节。本研究通过制备高效价CV-A5兔多克隆抗体及单克隆抗体，建立ELISA抗原检测方法，对其准确度、精密度、特异性、耐用性及稳定性进行方法学验证，并应用于非洲绿猴肾（Vero）细胞基质十层细胞工厂纯化病毒液过程中样品的抗原检测。

1 材料与方法

1.1 材料CV-A5、狂犬病毒疫苗（rabies virus vaccine，RV）、轮状病毒疫苗（rotavirus vaccine，Rota）、NoV、CV-A2、CV-A4、CV-A6、埃可病毒11型（echovirus 11，Echo11）、CV-A16、EV-71、SP2∕0骨髓瘤细胞、Vero细胞由武汉生物制品研究所有限公司保存；SPF级雌性BALB∕c小鼠、雄性日本大耳白兔由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供；HAT盐、HT盐、PEG∕DMSO（Mw，1450）、羊抗小鼠HRP-IgG和 羊抗兔HRP-IgG购自武汉博士德公司；抗体亚类鉴定试剂盒购自洛阳赛尔维实验器材有限公司；氯化铯（CsCl）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司；Pierce BCA定量分析试剂盒购自美国Thermo公司；ELISA相关试剂为本实验室配制。

1.2 方法

1.2.1 抗原制备及鉴定 取CV-A5（7.68 lgC CID50∕ml）按照0.001 MOI接种十层细胞工厂培养，37℃培 养48～72 h，细 胞 病 变（cytopathic effect，CPE）达90%时收获病毒液，浓缩，20%（W∕V）蔗糖垫底，蔗糖密度梯度离心、CsCl密度梯度离心等得到CV-A5纯化抗原，12% SDS-PAGE和透射电镜鉴定蛋白纯度和颗粒完整性，BCA法测定蛋白浓度，−20℃保存备用。

1.2.2 多克隆抗体和单克隆抗体制备、纯化及鉴定

1.2.2.1 多克隆抗体制备 将纯化的CV-A5抗原与等体积弗氏佐剂混合（初次免疫和第1次加强免疫佐剂为弗氏完全佐剂，后续加强免疫佐剂为弗氏不完全佐剂）［10］，背部皮下多点注射免疫日本大耳白兔，200 μg∕剂，免疫间隔为0、3、14、28、42 d各免疫1次，末次免疫10 d后，颈动脉采血，分离血清，即兔抗CV-A5多克隆抗体。

1.2.2.2 单克隆抗体制备 将纯化的CV-A5抗原与等体积弗氏佐剂混合（首次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，后续加强免疫佐剂为弗氏不完全佐剂），背部皮下及腹腔注射免疫雌性BALB∕c小鼠，60 μg∕剂，分别于0、14、28、42 d各免疫1次，第52天眼眶采血，分离血清，间接ELISA和中和试验检测血清效价。选择ELISA效价和中和抗体效价较高的小鼠进行冲击免疫，3 d后按照常规细胞融合技术将小鼠脾细胞与SP2∕0骨髓瘤细胞进行融合。采用间接ELISA法和中和试验方法筛选杂交瘤细胞，筛选出的阳性杂交瘤细胞经3次克隆后进行扩大培养，制备腹水。

1.2.2.3 抗体纯化及鉴定 采用三步饱和硫酸铵法纯化CV-A5兔多克隆抗体和CV-A5单抗腹水，间接ELISA法测定抗体效价［11］，SDS-PAGE法分析抗体纯度。

1.2.3 CV-A5内参制备 取1.2.1制备的CV-A5抗原，采用蛋白保护剂稀释至10 μg∕ml，分装保存作为内参。

1.2.4 CV-A5抗原检测法建立 包被CV-A5兔多克隆抗体从800 ng∕孔开始进行2倍系列陪比稀释，检测抗体2C2-HRP按照1：200进行2倍系列倍比稀释，方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度，建立CV-A5抗原检测方法。

1.2.4.1 包被抗体和检测抗体选择 为保证双抗体夹心ELISA体系最大程度捕获待测CV-A5抗原，选择高效价CV-A5兔抗血清纯化后的多抗作为包被抗体。为保证双抗体夹心ELISA体系的特异性，选择特异性强的单克隆抗体2C2作为检测抗体，采用过碘酸钠氧化法对2C2进行标记，偶联辣根过氧化物酶分子制备2C2-HRP。

1.2.4.2 CV-A5抗原检测方法建立 通过对ELISA检测条件的优化，建立CV-A5抗原检测方法。将纯化的CV-A5兔多抗用0.05 mol∕L碳酸盐缓冲液（pH=9.6）稀释至1 μg∕ml，包被微孔板，100 μl∕孔，4℃包被过夜。PBST洗板3次，加入封闭液（PBST配制的1% BSA），200 μl∕孔，37℃封闭1 h，弃封闭液37℃干燥2 h制备包被微孔板。加入稀释的待测样品，100 μl∕孔，37℃孵育1 h；洗板5次，加入2C2-HRP（1：1 000），100 μl∕孔，37℃孵育1 h；TMB显色30 min，2 mol∕L H2SO4终止反应，读取A450∕A630值，绘制CV-A5抗原含量与A450∕A630均值的标准曲线，得到标准品的线性公式，代入A450∕A630均值，计算CV-A5抗原含量。

1.2.5 CV-A5抗原检测方法验证 按照《中国药典》四部（2015版）通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求进行方法学验证［12］。

1.2.5.1 线性范围及灵敏度 采用含1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBST将CVA5内参依次稀释至1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6 ng∕ml，按照1.2.4进行检测，确定线性范围，重复检测5次。

1.2.5.2 特异性 采用建立的方法分别检测CVA5收获液、CV-A5空心颗粒（empty particles，EP）、CV-A5实心颗粒（full particles，FP）、RV、Rota、NoV、CV-A2、CV-A4、CV-A6、Echo11、CV-A16、EV-71、BSA、Vero细胞裂解液，各待检抗原的蛋白浓度均调整为10 μg∕ml。

1.2.5.3 准确度 将CV-A5内参稀释至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3个浓度，采用CV-A5抗原检测法分别对3个浓度样品进行检测，各样品平行检测5孔，试验重复测定2次，计算回收率。

1.2.6 精密度检测

1.2.6.1 重复性 将CV-A5内参稀释至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3个浓度，同一试验人员不同时间采用CV-A5抗原检测法分别对3个浓度样品进行3次检测，计算同一浓度样品测定结果的CV。

1.2.6.2 中间精密度 将CV-A5内参稀释至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3个浓度，不同试验人员采用CV-A5抗原检测法分别对3个浓度样品进行检测，计算同一浓度样品测定结果的CV。

1.2.7 耐用性检测 ①孵育时间变化检测每步孵育时间偏差对最终检测结果的影响，即每组操作加入待检抗原、酶结合物、底物A和B的孵育时间分别为55 min～55 min～25 min；60 min～60 min～30 min；65 min～65 min～35 min。②孵育温度变化检测孵育温度偏差对最终检测结果的影响，即每组操作中采用的孵育温度分别为35℃、37℃、39℃。③加样体积变化检测每步加样体积偏差对最终检测结果的影响，即每组操作中采用的加样体积分别为95 μl、100 μl、105 μl。

1.2.8 稳定性检测 将包被的酶标板置于37℃孵育3 d，将CV-A5内参稀释至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3个浓度，37℃孵育3 d和4℃放置的CV-A5抗原检测试剂分别对3个浓度样品进行检测，比较37℃孵育3 d和4℃放置试剂的检测结果差异。

1.2.9 建立检测方法的初步应用 用建立的方法检测CV-A5细胞工厂纯化过程样品1～7［CV-A5 Vero细胞病毒收获液、浓缩液、浓缩后废液、20%（W∕V）蔗糖垫底上清样品及重悬样品、CsCl密度梯度离心后样品］的抗原含量。

2 结果

2.1 CV-A5全病毒颗粒抗原鉴定12% SDSPAGE结果显示，纯化的CV-A5抗原在相应位置出现VP1、VP2和VP3目的蛋白条带，其他位置未出现明显条带（图1A）。电镜分析结果显示，纯化的CVA5全病毒颗粒直径为27～30 nm，形态完整，大小均一（图1B）。

图1 病毒颗粒纯化鉴定Fig.1 Purification identification of virus particle

2.2 单克隆抗体筛选鉴定 间接ELISA法共筛选出9株CV-A5单克隆抗体，9株单抗同时进行中和实验，结果显示，均无法中和CV-A5病毒，表明这9株单抗均无中和活性。其中，1A11和1H4可识别其他型别肠道病毒，为群特异性广谱单抗。其他与CV-A5特异性结合的单抗中，2C2仅与CV-A5反应，且ELISA效价最高，经抗体亚类鉴定其亚型为IgG2b（图2）。

图2 单克隆抗体特异性分析Fig.2 Specific identification of monoclonal antibody

2.3 CV-A5多克隆抗体和单克隆抗体纯化鉴定ELISA结果显示，抗CV-A5兔多抗及抗CV-A5单抗2C2腹水的效价分别为107和106。SDS-PAGE显示，纯化的CV-A5兔多抗及CV-A5单抗2C2腹水在相对分子质量50 kD～25 kD分别可见与预期重链、轻链相对分子质量一致的条带，其他位置未见明显条带（图3）。

图3 抗体纯化鉴定Fig.3 Purification identification of antibody

2.4 CV-A5抗原检测方法验证

2.4.1 标准曲线范围及灵敏度 重复检测3次的标准曲线方程分别为：y=514.48x-68.45，y=509.45x-64.57，y=502.11x-64.78，r2分 别 为0.98、0.98、0.97。检测范围为15.6～1 000.0 ng∕ml，检测范围内抗原含量与相应A值呈显著相关，r2＞0.97。

2.4.2 特异性 采用所建立的方法检测抗原，结果显示，抗原仅识别CV-A5收获液、EP、FP，而不识别其他型别肠道病毒、Rota、NoV、RV，说明所建立的抗原检测方法特异性良好（图4）。

图4 特异性验证结果Fig.4 Specific verification results

2.4.3 准确度CV-A5内参高、中、低3个浓度样品回收率分别为99.4%～128.7%，93.2%～103.1%，88.5%～95.0%，表明该方法准确度良好（表1）。

表1 准确度验证结果Tab.1 Accuracy verification results

2.4.4 定量检测方法精密度分析

2.4.4.1 重复性CV-A5内参高、中、低3个浓度样品CV分别为1.3%、3.2%、1.2%，表明该方法重复性良好（表2）。

表2 重复性验证结果Tab.2 Repeatability verification results

2.4.4.2 中间精密度CV-A5内参高、中、低3个浓度样品测定结果的CV分别为2.1%、2.2%和3.5%，表明该方法中间精密度良好（表3）。

表3 中间精密度验证结果Tab.3 Intermediate precision verification results

2.4.5 耐用性 理想操作即全程孵育温度为37℃，孵育时间60 min～60 min～30 min，加样体积为100 μl；偏差下限即全程孵育温度为35℃，孵育时间55 min～55 min～25 min，加样体积为95 μl；偏差上限即全程孵育温度为39℃，孵育时间65 min～65 min～35 min，加样体积为105 μl。高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3个浓度不同检测条件下，回收率为97.4%～127.6%，表明该方法耐用性良好（图5）。

图5 耐用性验证结果Fig.5 Durability verification results

2.4.6 稳定性CV-A5抗原检测试剂37℃孵育3 d后，用于检测500.0、250.0、125.0 ng∕ml的CVA5抗原含量，样品回收率为101.7%～106.9%，表明CV-A5抗原检测试剂稳定性良好（图6）。

图6 稳定性验证结果Fig.6 Stability verification results

2.5 方法应用 采用CV-A5抗原检测方法检测Vero细胞基质十层细胞工厂纯化过程样品检测，结果显示其可用于CV-A5纯化过程不同阶段样品的抗原含量监测（图7）。

图7 方法应用验证结果Fig.7 Method application verification results

3 讨论

近年来，CV-A5在中国大陆地区肠道病毒病原谱中日益活跃，但国内外对CV-A5的研究较少，CVA5单克隆抗体研制及相关抗原检测方法的建立鲜有报道。目前针对抗病毒类抗体的免疫原主要为全病毒和重组蛋白，重组蛋白作为免疫原制备的抗体存在反应性不佳、稳定性差、不与病毒发生反应等问题。本研究采用全病毒作为免疫原，制备高效价的单克隆抗体和多克隆抗体，并建立ELISA抗原检测方法。ELISA法检测病毒抗原具有快速、简单和成本低等优点，是目前应用广泛的方法［13］。ELISA反应体系易受外界因素影响，如加样体积、反应温度、反应时间、试剂稳定性等。本研究考虑到不同试验人员的操作误差，在最大误差波动范围内进行试验，回收率为97.4%～127.6%，并对其准确度、精密度、特异性及稳定性进行方法学验证，可初步应用于Vero细胞基质十层细胞工厂纯化过程及各阶段样品的抗原检测。抗原检测结果提示，抗原纯化过程中，不同纯化步骤存在不同程度抗原损失，可针对损失抗原较多的纯化方法进行改良，以减少不必要损失。

综上所述，本研究以CV-A5多克隆抗体为捕获抗体，以单克隆抗体2C2为检测抗体，初步建立了快速检测CV-A5抗原的双抗体夹心ELISA抗原检测方法。该方法准确性、精密度、特异性、耐用性等均符合《中华人民共和国药典》四部（2015年版）通则9101要求，可用于CV-A5抗原的定量检测，可为包含CV-A5的HFMD多价疫苗的质量控制和工艺开发提供参考。