ST7L通过调控WNT/β-catenin通路抑制非小细胞肺癌恶性行为①

孙乃辉 张 亮 袁 媛 张崇光（天津市宁河区医院普外科，天津301500）

肺癌是全球癌症相关死亡的主要因素之一，是男性中第1个最常见的恶性肿瘤，也是女性中第4大最常见癌症［1］。在全球范围内，肺癌的新发病例为182.5万例，占新发癌症病例总数的12.9%；肺癌癌症的死亡人数为1.59万人，占癌症总死亡人数的19.4%［2］。在中国，每年约有73.33万新发肺癌病例及61.22万人因肺癌死亡［3］。其中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要类型，占所有肺癌病例的85%，5年生存率非常低［4］。尽管已经开发了各种治疗技术，但由于目前已知的NSCLC特异性生物标记物的种类较少，可用于临床诊断的指标种类稀缺，可供作为抗原依赖性的免疫疗法的靶标数量也较少，导致在现有治疗标准体系下治愈率低［5］。因此，肺癌死亡率的成功降低需全面了解NSCLC的生物学过程和一些新的治疗策略。

肿瘤抑癌基因7L（tumor suppressor gene 7L，ST7L），也称为ST7R，STLR和FAM4B，位于染色体7q31区域，与同区域中发现的肿瘤抑制基因ST7为同源序列，与WNT2B基因在人类染色体1p13区以尾对尾的方式聚集。ST7L在多种癌症中表达下调，包括胃癌、神经胶质瘤、卵巢癌、肝细胞癌和甲状腺癌［6-10］。然而，ST7L在NSCLC中的重要性及其潜在机制尚未阐明。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2016年11月至2017年12月天津市宁河区医院病理科收治的25对NSCLC患者的肿瘤组织及其癌旁组织作为实验标本，标本采集经本院伦理委员会讨论通过。人NSCLC细胞系A549、H1299、H358、PC-9购自中国医学科学院上海细胞库；肺上皮永生化细胞系BEAS-2B购自天津ATCC分理处；ST7L的cDNA购自天津赛尔生物科技有限公司；TRIzol试剂购自Sigma公司；SYBR Green Master Mix RT-qPCR试剂盒购自南京康为试剂公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将细胞培养于含10%胎牛血清、100 μg∕ml链 霉 素、100 U∕ml青 霉 素 的RPMI1640培养基（DMED培养液亦可）。将上述细胞置于含CO2培养箱中37℃恒温培养，培养箱中CO2浓度设定为5%，采用0.025%的胰蛋白酶，每隔2～3 d对细胞进行消化、传代培养。

1.2.2 质粒构建 构建过表达ST7L的质粒。首先采用PCR法制备需要插入的外源片段，PCR实验的条件为：95℃预变性3 min，（95℃变性30 s、58℃退火40 s、72℃延伸2 min），共进行33个循环，72℃延伸12 min。琼脂糖凝胶实验回收的PCR产物大小约为1 700 bp，连接到pcDNA3载体上，获得名称为pcDNA3∕ST7L的过表达质粒。

1.2.3 RT-qPCR实验TRIzol法提取NSCLC组织和肺癌细胞中的总RNA，并反转录为cDNA，RT-qPCR试剂盒检测。实验步骤如下94℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，共计35个循环。按照2-ΔΔCt法，通过β-actin对ST7L基因mRNA水平进行内源性校正，每组分别重复3次。

1.2.4 CCK8实验 取对数生长期细胞，分别取5*103个H1299和A549细胞接种于96孔板，每孔培养液为100 μl，将96孔板置于含5% CO2的培养箱，37℃恒温培养18～24 h。待细胞贴壁后采用脂质体2000转染上述肺癌细胞；另外，将不含细胞的完全培养液加入标准空白孔中对照。在不同转染时间点结束时，将CCK8以100 μl∕孔逐一加入96孔板并继续孵育4 h后终止培养。再采用酶标仪测定各孔吸光度（A）值，设定450 nm处波长。每组选取3个孔进行平行实验，并重复3次。

1.2.5 细胞集落形成实验 将实验各组A549和H1299细胞置于6孔板中转染，待转染24 h后，选取0.25%的胰酶消化细胞并充分混匀，用10 μl微量移液器吸取后加入1.5 ml离心管，1 000 r∕min离心5 min后弃上清并收集细胞，收集完成后重悬细胞并计数，加入60 mm细胞培养皿（300个∕皿），置于CO2培养箱中连续培养14 d，至肉眼可见集落时，弃培养液，PBS洗涤2次。10%甲醛固定、结晶紫染色各10 min，最后用PBS洗净后晾干并拍照，实验累计重复3次。

1.2.6 Western blot实验 各组已转染细胞于48 h后，RIPA裂解液在4℃条件下裂解30 min。收集蛋白混合液至离心管，BCA试剂盒定量测定蛋白浓度。具体测定步骤如下：①在每个泳道上加注15 μg蛋白样品；②10%SDS-PAGE电泳后将蛋白转膜至PVDF膜，并用PBST封闭1 h；③将稀释好的一抗分别对应加入后，置于4℃水浴箱孵育过夜；④TBST连续洗膜3次，加入二抗并置于室温摇床内，继续孵育2 h后重复3次TBST洗膜；⑤ECL发光试剂盒（化学发光法辣根过氧化物酶底物）发光显影、定影及结果分析。

1.2.7 数据库分析 应用TCGA数据库分析ST7L在正常人与肿瘤患者组织的表达水平差异；应用GEO数据库分析ST7L在不同肿瘤分型的表达水平差异。

1.3 统计学分析 全部实验过程均按标准重复执行3次，数 据 性 实 验 结 果 用±s表 示，采 用SPSS19.0软件对实验数据进行统计学分析，以GraphPad6.0软件进行相关图片制作。组间数据差异的两两比较采用Bonferroni法检验；多组间数据差异比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC中ST7L表 达 水 平 降 低ST7L的mRNA水平在肿瘤组织中降低（图1A），且ST7L的表达水平与肿瘤的大小、TNM分期及远端转移呈负相关，差异有统计学意义（P＜0.05）；与年龄、性别及组织学分类差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。TCGA数据库分析结果表明，与正常组相比，ST7L mRNA水平在356例肿瘤组织中降低（图1B），肺癌细胞系中ST7L表达水平较其永生化的正常非上皮细胞降低（图1C），差异均有统计学意义。GEO数据库分析发现ST7L的表达水平与肺鳞癌及腺癌的分型无相关性（图1D）。

表1 NSCLC患者临床病理资料与ST7L表达分析Tab.1 Clinical characteristics and expression of ST7L in NSCLC patients

图1 ST7L在NSCLC中低表达Fig.1 ST7L was low expression in NSCLC

2.2 ST7L抑制A549和H1299细胞的增殖能力和周期进程，并促进细胞凋亡CCK8实验表明，过表达ST7L后，可在24 h、48 h、72 h时间点抑制A549和H1299细胞的活性（图2A）。集落形成实验表明，过表达ST7L可抑制A549和H1299细胞的增殖能力（图2B）。流式细胞术结果表明，过表达ST7L能够抑制A549和H1299细胞 由G1期向S期 和G2期的转换（图2C）。凋亡实验结果表明，过表达ST7L可促进了A549和H1299细胞的凋亡能力（图2D）。

图2 ST7L抑制A549和H1299细胞的增殖能力Fig.2 ST7L inhibits proliferation of A549 and H1299 cells

2.3 ST7L抑制WNT∕β-catenin信号通路的激活Western blot结果表明，过表达ST7L可抑制A549和H1299细胞中CTNNB1、C-MYC和Cyclin D1的表达水平（图3A、B）。TOP-FOP双荧光报告系统检测结果发现，过表达ST7L可抑制TOP∕FOP报告载体的活性（图3C）。免疫荧光实验结果表明，过表达ST7L可有效 抑制A549和H1299细 胞中CTNNB1由胞浆向胞核的转运（图3D）。

图3 ST7L失活WNT/β-catenin信号通路Fig.3 ST7L inactivated WNT/β-catenin signaling path⁃way

3 讨论

ST7L作为抑癌基因在肿瘤中的作用已被报道。例如，过表达ST7L可抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移侵袭能力［8］；ST7L在胶质瘤中抑制细胞的恶性行为，但其在NSCLC中的研究报道较少［7］。本研究发现，过表达ST7L后能显著抑制A549和H1299细胞的增殖能力和细胞周期进程，并促进细胞凋亡。

ST7L是ST7的同源基因，含有575个氨基酸，最早由KATOH等［11］借助cDNA-PCR和生物信息学预测手段确定。由于染色体区域的重组或等位基因的缺失，ST7L也可能发挥抑癌基因作用，并与miRNA的调控密切相关。近期研究表明，其在乳腺癌、宫颈癌、肝细胞癌、胰腺癌等的侵袭与转移中也发挥非常重要的调控作用［12-15］。

WNT信号通路是进化上高度保守的通路之一，通过膜受体蛋白与配体蛋白WNT结合，将胞外信号传递到胞内，负责调控机体胚胎发育、细胞命运及正常组织的均质稳定等关键的生物过程［16-17］。WNT途径的主要组分如下：WNT配体、卷曲蛋白受体、LRP5∕6共受体（低密度脂蛋白受体相关蛋白5∕6）、Dsh（Dishevelled）、β-连环蛋白和TCF∕LEF（T-细胞因子∕淋巴增强因子）及由APC（腺瘤性结肠息肉）、轴蛋白（脚手架蛋白）和两种激酶CK1α（酪蛋白激酶1α）和GSK-3β（糖原合酶激酶3β）组成的一种“降解复合物”［18］。WNT配体和β-连环蛋白在该途径中发挥关键作用［19］。当WNT信号通路被激活时，β连环蛋白被导入细胞核，其可与TCF∕LEF家族的转录因子相互作用，招募转录共激活p300和∕或CBP（CREB结合蛋白）以及其他组件子转录下游目标基因云，包括c-MYC的和细胞周期蛋白D1等［20］。

本篇研究构建了pcDNA3∕ST7L的过表达质粒，提取NSCLC组织和肺癌细胞中的总RNA并反转录为cDNA，通过CCK8、集落形成实验、细胞周期试验检测出ST7L在A549和H1299细胞中可通过抑制WNT信号的活化影响C-MYC和Cyclin D1的表达水平，从而有效抑制细胞增殖和周期进程并促进细胞凋亡。基于TCGA和GEO临床数据库，正常组织表达结果与NSCLC癌组织检测结果对照分析，也显示NSCLC中ST7L表达水平降低。

综上，课题组在NSCLC细胞中确定ST7L作为抑癌基因通过抑制WNT信号通路的活化，抑制A549和H1299细胞的增殖能力和细胞的周期进程，可能为临床诊断和精准治疗NSCLC提供了分子基础和新的策略。