黄芪多糖调节脂联素/TLR/NF-κB信号通路对溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用①

宋 艳 何永恒 杨 芳 罗 敏 刘 杨（湖南中医药大学第二附属医院肛肠科，长沙410005）

溃疡性结肠炎是一种慢性炎症性肠病，可见于任何年龄段人群，以20～30岁较为多见［1］。脂联素∕TLR∕NF-κB是调节机体炎症信号传递的信号转导通路，研究发现其与溃疡性结肠炎的发病机制密切相关［2］。黄芪多糖（astragalus polysaccharide，AP）是从传统中药材黄芪中提取得到的多糖类物质，具有抗炎、抗肿瘤等多种药理作用［3］。近年来有学者发现其对溃疡性结肠炎具有一定的治疗及改善作用，但其作用机制有待研究［4］。本文通过研究AP对溃疡性结肠炎小鼠的改善作用及脂联素∕TLR∕NF-κB信号通路的调节作用，旨在为AP在溃疡性结肠炎中的药理作用及机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：健康雄性C57BL∕6小鼠，清洁级，6～8周龄，体重20～22 g，湖南中医药大学动物实验中心，动物房温度22～24℃，湿度40%～75%，适应1周。药品及试剂：AP（黄芪产于内蒙古，由南京泽朗医药科技集团有限公司提取分离，分子量254.693，纯度＞90%）；柳氮磺吡啶肠溶片（上海信谊天平药业有限公司）；P-选择素、MIF及TXB2（武汉华美生物工程有限公司）；RIPA蛋白裂解液、RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒、SOD活性检测试剂盒、MDA检测试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、TLR4兔多克隆抗体、NF-κBp65及GAPDH兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、生物素标记山羊抗兔IgG购自碧云天生物科技有限公司；小鼠髓过氧化物酶（MPO）ELISA试剂盒购自艾博抗上海贸易有限公司；苏木素染液、伊红染液均购自源叶生物科技有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自美国Sciencell公司；TGF-β1 ELISA试剂盒购自江苏凯基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 溃疡性结肠炎小鼠模型的建立及给药90只小鼠随机分为对照组、模型组、AP低、中、高剂量组及阳性对照组，15只∕组。除对照组外，其余小鼠自由饮用当日现配的质量分数为3%DSS溶液连续7 d建立溃疡性结肠炎小鼠模型［5］。按照Cooper评分系统［6］根据小鼠体重减轻、大便性状、便血情况评定小鼠结肠组织疾病活动指数（disease activity index，DAI），同时随机取3只小鼠对结肠组织做病理学检查，以DAI升高及小鼠结肠病理性改变视为造模成功。根据前期预实验结果并参照文献确定给药剂量，AP低、中、高剂量组分别灌胃给予100 mg∕kg、200 mg∕kg、400 mg∕kg AP，阳性对照组灌胃给予300 mg∕kg柳氮磺吡啶（参照临床给药剂量的6.2倍及文献方法确定剂量），1次∕d，连续给药14 d，对照组及模型组小鼠给予生理盐水［5，7］。小鼠末次给药24 h后，评定DAI。

1.2.2 小鼠血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平的测定 断尾取血，4℃静置4 h，4℃下3 500 r∕min离心10 min，取上清，使用ELISA试剂盒检测血清TNFα、IL-6及TGF-β1水平。

1.2.3 小鼠结肠组织SOD、MPO活性、MDA、P-选择素、MIF及TXB2水平的测定 取小鼠结肠组织，按照试剂盒说明书检测SOD、MPO活性、MDA、P-选择素、MIF及TXB2水平。

1.2.4 HE染色检查结肠组织病理学变化 取厚度为5 μm的小鼠结肠组织石蜡切片，进行常规HE染色，光镜下盲法检查，参照文献方法，根据结肠组织溃疡程度、深度、水肿、炎症细胞浸润及程度评价组织病理学变化［8］。

1.2.5 实时定量PCR检测小鼠结肠组织中TLR4及NF-κBp65 mRNA水平RNA试剂盒提取小鼠结肠组织（每组取6只小鼠）RNA，逆转录为cDNA，实时PCR进行TLR4及NF-κBp65 mRNA表达量的检测。以GAPDH为内参，各基因相对表达量按照2-ΔΔCt方法计算。引物序列见表1。

表1 实时定量PCR检测的基因引物序列Tab.1 Sequence of gene primers for RT-qPCR detection

1.2.6 免疫组化检测小鼠结肠组织TLR4及NFκBp65水平 小鼠石蜡切片经双氧水封闭、热原修复、5%胎牛血清封闭，滴加TLR4及NF-κBp65一抗（1：200），4℃过夜。次日PBS洗涤3次，使用1：100倍稀释的山羊抗兔IgG在37℃恒温烘箱中孵育15 min，PBS液洗涤，室温DAB显色，显微镜下观察。参照文献方法，根据染色强度及阳性面积计算各蛋白表达积分［9］。

1.2.7 Western blot检测小鼠结肠组织TLR4及NFκBp65蛋白水平 取加入蛋白酶及磷酸化酶抑制剂的小鼠结肠组织匀浆液，12 000 r∕min，4℃离心10 min，水浴加热变性后测定蛋白浓度，取30 μg蛋白上样，电泳分离、转膜、封闭液封闭后，依次使用1：1 000稀释的TLR4、NF-κBp65及GAPDH抗体及1：2 000稀释的山羊抗兔IgG抗体孵育，PBST清洗后，滴加显影剂在凝胶成像系统成像，应用Image J软件进行定量分析。

1.3 统计学方法 数据统计及分析利用SPSS20.0软件，计量资料以表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，两两比较则采用LSD检验，作图使用Graphpad prism 8.0完成，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AP对溃疡性结肠炎小鼠DAI的影响 模型组溃疡性结肠炎小鼠DAI较对照组显著升高（P＜0.05），提示造模成功；与模型组溃疡性结肠炎小鼠比较，AP各剂量组及阳性对照组小鼠DAI显著降低（P＜0.05，表2）。

表2 各组小鼠的DAI指数（±s，n=15）Tab.2 DAI water of mice in different groups（±s，n=15）

表2 各组小鼠的DAI指数（±s，n=15）Tab.2 DAI water of mice in different groups（±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model AP-L AP-M AP-H Positive DAI 0.00±0.00 2.63±0.171）1.11±0.112）0.93±0.062）0.86±0.042）0.90±0.072）

2.2 各组小鼠结肠组织病理学检查 对照组小鼠结肠组织结构正常，无明显病理学变化；与对照组比较，模型组小鼠结肠黏膜不完整，出现炎症细胞浸润，上皮及隐窝被破坏，肠壁增厚，病理学评分显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，AP各剂量组及阳性对照组小鼠结肠组织病理学恢复，黏膜腺体排列较整齐，肠壁基本恢复，肌层病变明显减轻，炎症浸润减轻，病理学评分明显降低（P＜0.05，图1、2）。

图1 各组小鼠结肠组织病理学检查结果（HE，×200）Fig.1 Histopathological examination of colon in different groups of mice（HE，×200）

2.3 AP对溃疡性结肠炎小鼠血清TNF-α、IL-6、脂联素及TGF-β1水平的影响 模型组溃疡性结肠炎小鼠血清TNF-α、IL-6水平较对照组显著升高（P＜0.05），而脂联素及TGF-β1水平较对照组则显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，AP各剂量组及阳性对照组小鼠血清TNF-α、IL-6水平显著降低（P＜0.05），脂联素及TGF-β1水平显著升高（P＜0.05，表3）。

表3 各组小鼠的TNF-α、IL-6、脂联素及TGF-β1水平（±s，n=15）Tab.3 Levels of serum TNF-α，IL-6，TGF-β1 and Adipo⁃nectin in different groups of mice（±s，n=15）

表3 各组小鼠的TNF-α、IL-6、脂联素及TGF-β1水平（±s，n=15）Tab.3 Levels of serum TNF-α，IL-6，TGF-β1 and Adipo⁃nectin in different groups of mice（±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model AP-L AP-M AP-H Positive TNF-α（pg∕ml）15.37±0.51 77.92±2.451）42.68±1.442）37.65±2.132）18.10±1.492）17.41±1.512）IL-6（pg∕ml）24.60±1.72 174.88±2.571）53.86±1.952）43.67±1.882）29.77±1.222）27.24±1.892）Adiponectin（μg∕ml）7.76±0.14 5.13±0.071）6.34±0.032）6.91±0.042）7.53±0.062）7.28±0.082）TGF-β1（pg∕ml）567.13±36.16 198.71±21.641）263.43±29.612）319.97±37.472）406.73±21.442）484.74±27.172）

2.4 各组小鼠结肠组织P-选择素、MIF及TXB2水平的比较 与对照组比较，模型组小鼠结肠组织P-选择素、MIF及TXB2水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，AP各剂量组及阳性对照组小鼠结肠组织P-选择素、MIF及TXB2水平显著降低（P＜0.05，表4）。

表4 各组小鼠结肠组织的P-选择素、MIF及TXB2水平（±s，n=15）Tab.4 Levels of P-selectin，MIF and TXB2 in colonic tis⁃sue of mice in different groups（±s，n=15）

表4 各组小鼠结肠组织的P-选择素、MIF及TXB2水平（±s，n=15）Tab.4 Levels of P-selectin，MIF and TXB2 in colonic tis⁃sue of mice in different groups（±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model AP-L AP-M AP-H Positive P-selectin（μg∕L）297.68±73.16 864.71±89.411）537.14±48.582）383.66±74.802）313.64±43.712）289.27±52.692）MIF（ng∕L）1968.59±144.82 6311.05±327.121）5038.13±348.512）4374.80±377.072）3873.07±263.272）2109.30±300.062）TXB2（mg∕L）81.96±3.27 265.31±2.641）195.04±2.072）137.18±3.072）108.73±2.772）91.39±3.572）

2.5 各组小鼠结肠组织SOD、MPO、MDA水平的比较 模型组溃疡性结肠炎小鼠结肠组织SOD活性较对照组显著降低（P＜0.05），MPO活性及MDA水平较对照组显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，AP各剂量组及阳性对照组小鼠结肠组织SOD活性显著升高（P＜0.05），MPO活性及MDA水平显著降低（P＜0.05，表5）。

表5 各组小鼠结肠组织的SOD、MPO、MDA水平（±s，n=15）Tab.5 SOD，MPO and MDA level in colonic tissue of mice in different groups（±s，n=15）

表5 各组小鼠结肠组织的SOD、MPO、MDA水平（±s，n=15）Tab.5 SOD，MPO and MDA level in colonic tissue of mice in different groups（±s，n=15）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs model group.

Groups Control Model AP-L AP-M AP-H Positive SOD（U∕mgprot）84.35±1.59 34.40±2.921）47.82±1.992）58.72±2.612）69.44±1.402）78.84±2.072）MDA（nmol∕mgprot）0.76±0.04 4.42±0.191）2.35±0.072）1.51±0.092）0.87±0.062）0.83±0.072）MPO（U∕mgprot）0.63±0.08 3.41±0.131）1.51±0.052）1.21±0.072）1.07±0.092）0.96±0.042）

图2 大鼠结肠组织病理学评分Fig.2 Histopathological score of colon in rats

2.6 各组小鼠结肠组织TLR4及NF-κBp65 mRNA水平比较 模型组溃疡性结肠炎小鼠结肠组织TLR4及NF-κBp65 mRNA水平较对照组小鼠显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，AP各剂量组及阳性对照组小鼠结肠组织TLR4及NF-κBp65 mRNA水平显著降低（P＜0.05）。见图3。

图3 各组小鼠结肠组织的TLR4及NF-κBp65 mRNA水平Fig.3 Levels of TLR4 and NF-κBp65 mRNA in colonic tissue of mice in each group

2.7 各组小鼠结肠组织TLR4、NF-κBp65免疫组化表达评分比较 模型组溃疡性结肠炎小鼠结肠组织TLR4、NF-κBp65免疫组化表达评分较对照组显著升高（P＜0.05），且TLR4主要在细胞膜表达，NFκBp65主要在细胞核表达；与模型组比较，AP各剂量组及阳性对照组小鼠结肠组织TLR4、NF-κBp65免疫组化表达评分显著降低（P＜0.05）。见图4。

图4 各组小鼠结肠组织的TLR4、NF-κBp65免疫组化表达评分Fig.4 Immunohistochemical expression score of TLR4 and NF-κBp65 in colonic tissue of mice in each group

2.8 各组小鼠结肠组织TLR4、NF-κBp65水平比较 见图5，模型组溃疡性结肠炎小鼠结肠组织TLR4、NF-κBp65蛋白水平较对照组显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，AP各剂量组及阳性对照组小鼠结肠组织TLR4、NF-κBp65蛋白水平显著降低（P＜0.05）。

图5 各组小鼠结肠组织的TLR4、NF-κBp65水平Fig.5 Levels of TLR4 and NF-κBp65 in colonic tissue of mice in each group

3 讨论

溃疡性结肠炎是以腹泻为主要临床表现，以结肠及直肠慢性非特异性炎症性为病理特征的疾病，患者常出现排脓血便及黏液便，并伴有阵发性结肠痉挛性疼痛，其发病机制及病因目前尚不明确，普遍认为其发病是外源物质引起宿主反应、基因和免疫三者相互作用的结果［10］。中医理论认为，脾胃虚弱为溃疡性结肠炎发病之本，浊毒内蕴为发病之标，饮食不节制及情志不调为诱发因素，进而引发大肠湿热，腑气壅滞，气滞血阻，肠络受损。在溃疡性结肠炎发作期，患者体内浊毒盛行，脾胃失调，运化失权导致水湿泛滥，浊而不化，郁结不散，下结于肠腑。气血于肠腑停滞，淤而不通，导致血肉腐败，酿化为脓。病情缓解时，患者体内浊毒虽有减弱之势，但仍潜伏于体内，如遇浊毒内邪浮动，浊毒再次累及肠络，痈疡继而再次形成，因此表现出时发时止的特征。中医理论认为溃疡性结肠炎久治不愈，反复难愈的根结在于肠内浊毒形成引起阳气难以通达，伤津耗液并累及多脏。本实验选用柳氮磺吡啶作为阳性对照组药物。柳氮磺吡啶是目前临床上用于治疗溃疡性结肠炎的常用药物之一，但其在临床使用中易出现药疹、剥脱性皮炎、中性粒细胞缺乏等多种不良反应，所以对于治疗溃疡性结肠炎药物的研发仍是目前的工作重点之一。

黄芪来源于豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪（As⁃tragalus propinquus Schischkin）的干燥根。黄芪古称黄耆，所谓“耆”，是众多中药材里面的补药之长。其色黄入脾，所以自古以来黄芪广泛应用于众多补脾补气的中药方剂中，具有益气固表、补气升阳、生津养血等补益的功用。AP是从中药材黄芪中提取分离得到的水溶性杂多糖，研究表明其对糖尿病肾病、脓毒症、视网膜病变、软骨细胞损伤、肿瘤等多种疾病都具有一定的改善及治疗作用［3］。近年来研究发现AP对溃疡性结肠炎也具有显著的改善作用，其中，郭艳等［11］研究表明AP能够调节Th17相关细胞因子，减轻溃疡性结肠炎大鼠的炎症反应；奚沁华等［12］也报道了AP能够修复溃疡性结肠炎小鼠的肠道黏膜，改善小鼠的疾病转归及预后。

TGF-β1是一种抗炎症性细胞因子，能够下调过度的免疫反应而抑制炎症的发生，并促进上皮细胞的修复［13］；TNF-α、IL-6是反映体内炎症水平的重要指标，其水平的升高提示炎症进展或加剧［14］；SOD活性及MDA水平的升高提示机体存在一定程度的氧化应激损伤，且机体的自我修复能力下降［15］；MPO是中性粒细胞分泌的一种酶，其水平的升高可促进炎症效应细胞的增殖与活化，加重体内炎症反应［16］；P-选择素、MIF及TXB2均是与炎症相关的细胞因子，其水平的升高，能够抑制巨噬细胞游走，促进巨噬细胞在炎症部位聚集，引发局部炎症反应［17］。本文研究结果表明，与模型组比较，AP能够显著降低溃疡性结肠炎小鼠血清TNF-α、IL-6水平，抑制结肠组织MPO活性、MDA、P-选择素、MIF及TXB2水平，并且血清TGF-β1水平及结肠组织SOD活性增加，缓解小鼠体内的炎症状态。

脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽，研究发现［18］脂联素具有抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力，其在炎症相关疾病的发病机制及疾病进展中，与体内炎症因子水平及炎症细胞数呈负相关。临床研究显示，脂联素与溃疡性结肠炎患者体内炎症因子水平密切相关，并能够反映患者的疾病程度，影响疾病转归，并影响体内TLR∕NFκB信号通路相关蛋白的表达［19］。TLR∕NF-κB信号通路普遍存在于真核细胞中与免疫及炎症信号传递及表达密切相关的信号转导通路［20］。已有研究［21］证实其在溃疡性结肠炎结肠组织中异常表达，抑制TLR∕NF-κB信号通路的激活能够改善溃疡性结肠炎大鼠的炎症反应，促进结肠黏膜的恢复。结果表明，AP能够降低溃疡性结肠炎小鼠结肠组织TLR4、NF-κBp65水平，升高脂联素水平，改善小鼠结肠组织病理学变化，这表明AP可能通过调节脂联素∕TLR∕NF-κB信号通路，进而抑制小鼠体内炎症因子释放，抑制溃疡性结肠炎小鼠体内炎症反应，并通过激活体内TGF-β1及SOD等抗氧化损伤的自我修复系统，促进机体自我恢复，进而发挥其抗溃疡性结肠炎的作用。

综上所述，AP能够显著改善溃疡性结肠炎小鼠体内炎症水平及组织氧化应激损伤，促进结肠组织病理学恢复，其机制可能与调节脂联素∕TLR∕NFκB信号通路有关。