骨关节炎患者免疫炎症关键蛋白表达谱变化及中医药的干预研究①

鲍丙溪 刘 健 万 磊 黄 旦 张 颖 龙 琰 孙广瀚

（安徽中医药大学第一附属医院，合肥230031）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是关节疾病中较常见的，全球约有2.5亿人，占所有关节疾病的40%左右［1-2］。近年来，骨关节炎的患病率和负担大大增加，生活水平的提高、人口老年化和肥胖人口的增加也成为发病率增高的因素［3-4］。

关节软骨的破坏是OA最显著的特征，包括滑膜、Ⅱ型胶原、聚集蛋白多糖、软骨下骨和关节周围软组织的破坏，并伴有关节功能障碍［5-6］。骨关节炎主要表现为膝关节疼痛、肿胀、压痛、僵硬，严重活动性肿胀，甚至不能活动［7］。除了关注疾病，我们还需要关注与疾病相关的生理、心理和社会互动。与其他慢性疾病相比，OA患者的岁数相对较低。OA不仅给患者带来疼痛，而且对其自身的社会交往也有很大影响，造成负面情绪，导致患者感受降低［8］。

本研究采用Raybiotech抗体芯片检测OA患者体内与免疫炎症相关蛋白的变化情况，应用ELISA进行验证，并探究中医药对OA患者变化的差异蛋白及实验室指标的影响，探究其改善OA的作用机制。

1 资料与方法

1.1 资料 收集10例OA患者和10例健康人，利用蛋白芯片进行关键蛋白筛选。30例OA治疗前后患者和30例健康人，利用ELISA进行关键蛋白验证，所有实验组检测样本均来自2018年12月至2019年2月安徽中医药大学第一附属医院风湿科住院患者，健康对照组来自医院健康体检中心。两组数据在年龄、性别上无差异。本研究获得我院伦理委员会的批准（伦理审查号：2014AH-06），患者知情且签署同意书。①诊断标准：西医诊断标准按照1995年美国风湿病学会（ACR）修订的诊断标准［9］及2007年中华医学会骨科学分会骨关节炎诊断及治疗指南［10］。②排除标准：排除合并其他风湿性疾病，排除严重原发性心血管疾病、呼吸系统疾病、糖尿病、妊娠期及哺乳期妇女、患有精神疾病无法配合的患者。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 实验组：新风胶囊联合中药饮片口服（新风胶囊：由薏苡仁、黄芪、蜈蚣、雷公藤组成，安徽中医药大学第一附属医院制剂，皖药制Z20050062，规格：0.34 g∕粒，3粒∕次，3次∕d；中药汤剂内服，1剂∕d，早晚分服），对照组：仅内服中药汤剂，1剂∕d。

1.2.2 数据分析

1.2.2.1 OA患者免疫炎症差异蛋白筛选 芯片扫描得到的原始数据经Raybiotech软件进行芯片背景去除、芯片间归一化处理。然后选择Result数据来做分析。两组间比较分析方法为moderated t-statistics，数据包为limma，来自R∕Bioconductor；采用adjustPvalue（或Pvalue）和logFC（表达差异倍数，以2为底）对差异蛋白进行筛选；3组比较分析方法为One-way ANOVA，数据包为stats。

1.2.2.2 生物信息学分析 主成分分析（PCA）和基因本体分析（GO）分别鉴定了差异表达蛋白及其功能。京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析差异表达蛋白具有的主要生物学功能及其参与的主要生化代谢和信号转导途径。层次聚类分析差异蛋白表达模式。PCA数据包“ggfortify”、GO及KEGG富集分析数据包“clusterProfiler”、层次聚类分析数据包“gplots”。

1.2.2.3 关联规则分析 关联规则中将治疗后指标改善设为T，反之为F，前项为中药或新风胶囊联合中药，后项为关键蛋白和免疫炎症实验室指标。设定最小支持度及置信度，若生成的关联规则中所有数据大于最小设定值，则被称为强关联规则［11］，计算公式如下［12］：

1.2.2.4 观察指标 关键蛋白：B7-1、ICOS、PD-L2；免疫炎症指标：免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、补体C3、补体C4、血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）；患者感受相关指标：患者焦虑量表（SAS）、患者抑郁量表（SDS）、SF-36量表（生理机能PF、生理职能RP、躯体疼痛BP、一般健康GH、精力VT、社会功能SF、情感职能RE、精神健康MH）。

1.3 统计学分析 数据用SPSS21.0统计软件进行处理，计量资料以±s表示，计数资料以率表示，治疗前后应用配对t检验，多组数据比较采用One-way ANOVA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋白芯片筛选OA免疫炎症相关蛋白 选取OA组10例，男1例，女9例，平均年龄（59.8±9.5）岁；对照组10例，女8例，男2例，平均年龄（58.0±9.3）岁，两组年龄、性别基线差异无统计学意义（P＞0.05）。ELISA验证OA免疫炎症相关蛋白，选取OA患者治疗前及治疗后30例，女24例，男6例，平均年龄（60.6±10.6）岁；对照组30例，女性26例，男性4例，平均年龄（55.3±8.9）岁，两组年龄、性别基线差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 抗体芯片检测OA患者血清蛋白表达谱

2.2.1 OA潜在生物标志物的鉴定 通过火山图（图1A）和散点图（图1B）对OA组蛋白与Control组蛋白进行比较，结果表明，OA组血清蛋白表达与Control组有显著差异。其中OA组3个蛋白较Control组有显著变化，OA组B7-1、ICOS、PD-L2均下调。

2.2.2 OA患者血清蛋白表达谱 图1A火山图表示有3个差异蛋白表达；图1B中蓝色表示下调蛋白，红色表示上调蛋白；图1C中红色表示对照组，蓝色表示OA患者，其中各样本前两个主成分（PC1和PC2）显示，总变异率为84.05%和15.03%（图1C），提示OA患者与对照组的蛋白表达模式存在差异；图1D为差异蛋白热图，将样本分为4个主要类群，第一类群包括3例OA患者和6例对照组，第二类群包括3例OA患者和1例对照组，第三类群仅包括3例OA患者，第四类群包括1例OA患者和3例对照组。

图1 OA患者和对照组蛋白表达谱Fig.1 Protein expression profiles of OA patients and con⁃trols

2.2.3 生物信息学分析 通过GO富集分析显示，有显著功能项25个，其中BP功能项20个（图2A），MF功能项3个（图2B），CC功能项2个（图2C）。KEGG富集分析显示，DEPs在12个途径中显著富集（图2D）。以上富集的信息和信号通路可能反映了OA的发病机制。

图2 OA生物信息学分析Fig.2 OA bioinformatics analysis

2.3 关键蛋白验证 选取30例治疗前后OA患者，通过ELISA对芯片筛选出的3个与OA免疫验证相关的蛋白进行验证，结果显示，OA组与对照组相比较，B7-1、ICOS、PD-L2（图3）3个蛋白显著下调（P＜0.01）。

图3 ELISA验证差异蛋白变化Fig.3 Changes of DEPs were verified by ELISA

2.4 OA患者治疗前关键蛋白与相关指标的相关性分析 利用Spearman相关性检验，结果显示ICOS与ESR、CRP、补体C3、补体C4及BP呈显著负相关，B7-1与SAS呈显著正相关（图4）。

图4 关键蛋白与相关指标的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of key proteins and related indexes

2.5 OA患者治疗前后差异蛋白及相关指标改善情况 选取30例治疗前后OA患者，比较OA患者治疗前后差异蛋白及相关指标改善情况，结果显示OA患者治疗后B7-1、ICOS和PD-L2（P＜0.01），ESR、补体C4、SAS和BP（P＜0.05）均有明显改善，差异具有统计学意义（图5）。

图5 OA患者治疗前后蛋白及相关指标变化情况Fig.5 Changes of protein and related indexes in OA patients before and after treatment

2.6 两组患者治疗前后差异蛋白及相关指标改善情况 选取30例治疗后OA患者，其中对照组19例，实验组11例，比较对照组和实验组患者治疗后相关指标情况，结果显示实验组治疗后患者的CRP和IgA的改善情况相比对照组（图6），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图6 两组患者治疗前后差异蛋白及相关指标变化情况Fig.6 Changes of DEPs and related indexes before and after treatment in two groups

2.7 中药与患者实验室指标及其他相关指标的关联规则分析 选取30例OA患者，调取患者使用中药情况，设定前项为单味中药，设定后项为免疫炎症相关差异蛋白和免疫炎症实验室指标，设置最小支持度为50%，最低置信度为90%，经Aprior模块分析，差异蛋白B7-1的上升与陈皮、蒲公英有强关联；ICOS的上升与牡丹皮、蒲公英、丹参有强关联；PD-L2的上升与桃仁、山药和薏苡仁有强关联，以上结果支持度均＞50%，置信度＞90%，提升＞1，见表1。

表1 对照组与差异蛋白的关联规则分析Tab.1 Analy association rules between control group and related indexes

设定前项为新风胶囊联合中药，设定后项为免疫炎症相关差异蛋白和免疫炎症实验室指标，设置最小支持度为30%，最低置信度为70%，经Aprior模块分析，IgA、IgG、ESR和CRP的下降及差异蛋白ICOS、PDL2的上升均与新风胶囊联合山药有强关联，以上结果支持度均＞30%，置信度＞70，提升＞1，见表2。

表2 实验组与差异蛋白及免疫炎症实验室指标的关联规则分析Tab.2 Association rule analysis of experimental group and relevant laboratory indexes

3 讨论

OA是一种退行性骨关节疾病，以慢性滑膜炎、关节软骨变性和软骨下骨重塑为特征［13］。红细胞沉降率（ESR）和c反应蛋白（CRP）是显著反映炎症变化的指标。ESR和CRP浓度是诊断膝关节疼痛（包括并发症）的重要诊断方法。另外补体系统是先天免疫的重要组成部分，在OA患者滑膜和滑膜组织中可以检测到［14］。修复软骨紊乱引起的软骨细胞外基质的释放以及软骨细胞凋亡特征的改变所致的病理变化，与激活补体系统有一定的关联，能显著增强OA的病理反应［15］。

ICOS是CD28家族的一员。ICOS信号在维持T淋巴细胞效应和记忆细胞活化、免疫球蛋白转换、调节Th细胞极化等方面发挥重要作用［16］。ICOS及其特异性配体（ICOSL）有激活诱导和调控免疫应答的特征，推测ICOS∕ICOSL信号可能参与OA的发生发展，从而参与调节OA的免疫损伤和免疫紊乱［17］。B7-1蛋白表达于抗原呈递细胞（APC）表面，在固有免疫系统中的作用是在免疫激活和免疫抑制之间建立平衡关系。B7-1及其受体，包括CD28、CTLA4和PD-L1，对机体的稳定起着调节控制作用［18］。PDL2是B7-DC家族成员，是抑制T细胞免疫应答的重要调控分子，参与多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的发病机制［19］。关于B7-1和PD-L2在骨关节炎中的作用，相关文献较少，尚需进行大量的临床研究或者动物实验研究。

本研究使用蛋白芯片来分析OA患者和对照组血清中关键免疫炎症蛋白的表达，获得3个差异蛋白并进行相关蛋白分析（GO、KEGG pathway、PCA），以了解OA新的发病机制。GO和KEGG富集分析表明，免疫炎症的关键蛋白在OA的发生中起关键作用。蛋白芯片筛选结果显示，与OA相关的关键蛋白为ICOS、B7-1和PD-L2，经ELISA验证，其表达较对照组下调（P＜0.01）。中医治疗OA以安全、费用低、患者痛苦小，可以改善患者关节功能及生活质量而更容易被患者所接受。本次研究结果显示：通过相关性分析，ICOS与ESR、CRP、补体C3、补体C4及BP呈显著负相关，B7-1与SAS呈显著正相关，与临床实际相符合；OA患者治疗后B7-1、ICOS、PD-L2、ESR、补体C4、SAS和BP均有明显改善（P＜0.05）；比较单纯中药组和中药联合新风胶囊组患者治疗后相关指标情况，结果显示使用中药联合新风胶囊治疗后患者的CRP和IgA的情况较使用单纯中药治疗后改善较好；通过中药与相关指标进行关联规则分析，结果显示差异蛋白B7-1的上升与陈皮、蒲公英有强关联；ICOS的上升与牡丹皮、蒲公英、丹参有强关联；PD-L2的上升与桃仁、山药和薏苡仁有强关联，IgA、IgG、ESR和CRP的下降及差异蛋白ICOS、PD-L2的上升均与新风胶囊联合山药有强关联。研究表明陈皮、蒲公英、丹参、桃仁和山药等有抗炎、抗菌、调节免疫的作用［20-24］，对调节差异蛋白有着重要作用；新风胶囊是延续新安从脾治痹思想的基础上研制的中成药［25-27］，通过关联规则分析可知新风胶囊与山药联合使用可以对免疫炎症指标及关键蛋白的调节有重要的作用，这与新风胶囊的药物组成可能有密切联系。新风胶囊主要由黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等组成。组方中各药都具有一定的抗炎镇痛的效果。黄芪、薏苡仁有益气健脾作用，能够调节雷公藤的毒副作用造成患者免疫力低下的不良反应。现代药理研究证明，黄芪能增加巨噬细胞的数量以及提高其吞噬能力［28］。雷公藤具有祛风湿、活血化瘀、通络止痛的作用，能抗炎镇痛、抑制白介素等细胞因子的表达，从而达到良好的治疗效果［29］。文建庭等［30］通过数据挖掘的方法研究新风胶囊联合中药与单纯中药治疗OA疗效差别，研究显示经过随机行走模型的分析，新风胶囊联合中药在降低OA患者ESR和hs-CRP的效果优于单纯中药组；汪元等［31］观察中药内服外敷对OA的疗效，发现新风胶囊联合中药内服与外敷在改善ESR、ALP、PLT、SOD等方面优于硫酸氨基葡萄糖组，对患者的生活质量也有一定的改善；谈冰等［32］研究也发现新风胶囊治疗OA患者，在降低P65、TRAF、IL-17、hs-CRP、ESR，升高IL-4方面明显优于硫酸氨基葡萄糖组。新风胶囊在临床应用数年，在治疗骨关节炎上疗效显著。

应用蛋白芯片检测OA患者血清中与免疫炎症相关的蛋白表达情况，进一步明确RA的发病机理，发现新的诊断标志物。从上述研究可知，中医药对改善骨关节炎关键蛋白的表达有重要的作用，尤其是新风胶囊联合中药不仅在改善关键蛋白上有明显作用，在对免疫炎症实验室指标的改善上同样发挥着重要的调节作用。由于骨关节炎的蛋白表达研究相对较少，其机制还需进一步研究验证。