干扰FUT8的表达抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭能力的作用及机制

卞艳丽,张春瑞*,宋书波,张体鹏

(1.郑州澍青医学高等专科学校临床医学,郑州 450000;2.河南省人民医院心血管外科,郑州 450000)

结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,是发达国家与肿瘤相关死亡的第二大常见原因。世界卫生组织统计数据显示,2018年全球结直肠癌病例180万例,约有88万例结直肠癌死亡病例,已成为世界范围内的公共卫生问题[1]。尽管结直肠癌在诊断和治疗方面取得了显著的进步,但是患者的存活率仍然较差[2]。结直肠癌的发生和发展是一个多因素及复杂的过程,与其它类型肿瘤一样,几种关键信号通路中的驱动程序突变会促进结直肠癌的发生发展[3]。异常糖基化被视为肿瘤的标志,涉及细胞信号传导、免疫调节和肿瘤增殖、侵袭等过程[4]。岩藻糖基转移酶8(fucosyltransferase 8,FUT8)催化α-1,6-键的岩藻糖转移到最内层N-乙酰氨基葡糖中,完成核心岩藻糖基化[5]。FUT8异常表达促进乳腺癌、非小细胞肺癌和肝细胞肝癌等恶性肿瘤的增殖、侵袭和耐药等肿瘤的恶性生物学特性[6-8]。Noda等[9]研究报道FUT8蛋白的表达可能成为II期和III期结直肠癌患者预后的生物标志物。但是FUT8在结直肠癌中发挥的具体作用未知,因此本文研究了FUT8对结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响及作用机制,旨在获得FUT8作为结直肠癌新型治疗靶点的实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞

结直肠癌细胞SW480购自上海中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

L15细胞培养基、胎牛血清和胰酶购自美国Hyclone公司;FUT8 siRNA购自上海生工生物技术有限公司;脂质体2000购自美国Invitrogen试剂公司;蛋白裂解液购自北京索莱宝试剂公司;BCA检测试剂盒购自美国Thermo公司;5×蛋白上样缓冲液和ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天科技有限公司;PVDF膜购自迈博瑞生物膜技术有限公司;CCK8试剂购自日本同仁化工试剂有限公司;Boyden小室购自美国BD公司;FUT8、AKT、pAKT和β-catenin抗体购自美国proteintech公司。

1.3 实验方法

1.3.1 基因表达谱数据动态分析(GEPIA)数据库分析结直肠癌组织中FUT8的表达水平

于GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)中“表达”菜单中输入FUT8基因,选择结直肠癌进行分析。

1.3.2 细胞培养和细胞转染

SW480细胞从液氮复苏后重悬至含有10%胎牛血清的L15细胞培养基中,放置在37℃、5%CO2的全湿度培养箱中培养。SW480细胞呈对数生长时,采用胰酶收集细胞进行计数,接种至6孔板中,每孔1×105个细胞,分为si-NC组和si-FUT8组。培养箱中培养12 h后,将脂质体2000与NC siRNA混合后转染至si-NC组细胞中,脂质体2000与FUT8 siRNA混合后转染至si-FUT8组细胞中。8 h后更换新鲜培养基,放置培养箱中继续培养进行后续实验。

1.3.3 Western blot检测蛋白表达

胰酶消化收集细胞,PBS洗3次,加入适量蛋白裂解液吹打细胞。超声裂解细胞30 min,4℃、14000 r/min离心30 min,弃掉细胞沉淀,吸取液体移至新的EP管中。按照BCA试剂盒说明书检测细胞蛋白浓度,并加入5×蛋白上样缓冲液混匀后沸水煮5 min。SDS-PAGE凝胶电泳80 V电泳120 min,100 V湿转100 min。5%BSA常温孵育PVDF膜1 h,目的一抗稀释液(FUT8、AKT、pAKT和β-catenin抗体稀释比均为1∶500)4℃孵育过夜。TBST洗3次,兔二抗稀释液(1∶10000)室温孵育1 h,TBST洗3次后,加ECL发光液进行曝光。

1.3.4 CCK8实验检测细胞增殖

在待测样品96孔中加入10μL CCK8试剂,培养箱中继续孵育1 h。酶标仪450 nm波长处检测每个样品孔的吸光度值(OD值)。

1.3.5 Boyden实验检测细胞侵袭

胰酶消化收集待测细胞,无血清培养基将胰酶和血清洗去后进行计数,接种至Boyden小室的上室中,每孔1×105个细胞。将Boyden小室放入含有10%胎牛血清的500μL细胞培养基的24孔板中,作为Boyden小室的下室,放置培养箱中培养。培养16 h左右,细胞由上室穿入下室时,终止培养。将Boyden小室上未穿过的细胞采用PBS洗去,甲醇固定,结晶紫染色。显微镜下拍照,计数穿膜细胞的个数。

1.3.6 SC79处理回复实验

SW480细胞呈对数生长时,采用胰酶收集细胞进行计数,接种至6孔板中,每孔1×105个细胞,分为si-NC组、si-FUT8组、si-NC+SC79组和si-FUT8+SC79组。si-NC组和si-FUT8组分别转染NC siRNA和FUT8 siRNA,si-NC+SC79组和si-FUT8+SC79组分别转染NC siRNA和FUT8 siRNA的同时加入SC79试剂,处理48 h后进行后续实验。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析,数据均以平均数±标准差(±s)表示,两组间的统计学差异采用独立样本t检验比较。两组以上的统计学差异采用方差分析比较,两两间的比较采用LSD-t检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 FUT8在结直肠癌组织中的表达水平

采用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析FUT8在结直肠癌组织中的表达水平,结果显示FUT8 mRNA在结直肠癌组织中的表达水平显著高于其在正常结直肠组织中的表达水平,P＜0.05,见图1。

图1 TCGA数据库分析FUT8在结直肠癌中的表达Note.Compared with normal colorectal tissues,*P＜0.05.Figure 1 TCGA database analyzed the expression of FUT8 in colorectal cancer

2.2 FUT8 siRNA敲减效果

结直肠癌细胞系SW480感染FUT8 siRNA,采用Western blot检测FUT8 siRNA干扰效果,结果显示si-NC组SW480细胞中FUT8的相对表达量为(0.35±0.05),si-FUT8组SW480细胞中FUT8相对表达量为(0.08±0.02)。si-FUT8组中FUT8相对表达量显著低于si-NC组(t=8.132,P=0.001),见图2。

图2 Western blot检测FUT8 siRNA转染效果Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 2 Western blot detected the transfection effect of FUT8 siRNA

2.3 敲低FUT8对结直肠癌细胞增殖能力的影响

采用CCK8实验检测FUT8对结直肠癌细胞增殖能力的影响,结果显示与si-NC组SW480细胞相比,si-FUT8组SW480细胞增殖能力显著降低,P＜0.05,见图3。

图3 CCK8检测结直肠癌细胞SW480增殖能力Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 3 CCK8 detected the proliferation ability of colorectal cancer cells SW480

2.4 敲低FUT8对结直肠癌细胞侵袭能力的影响

采用Boyden实验检测FUT8对结直肠癌细胞侵袭能力的影响,结果显示si-NC组SW480细胞中FUT8的相对表达量为(52.67±4.72),si-FUT8组SW480细胞中FUT8相对表达量为(25.00±4.58),与si-NC组SW480细胞相比,si-FUT8组SW480细胞侵袭能力显著降低(t=7.280,P=0.002),见图4。

图4 Boyden实验检测结直肠癌细胞SW480侵袭能力Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 4 Boyden experiment detected the metastasis of colorectal cancer cells SW480

2.5 SC79对转染FUT8 siRNA的结直肠癌细胞增殖能力的影响

采用CCK8实验检测SC79对转染FUT8 siRNA的结直肠癌细胞增殖能力的影响,结果显示si-NC组和si-NC+SC79组SW480细胞增殖能力无差异,与si-NC组和si-NC+SC79组相比,si-FUT8组和si-FUT8组+SC79组细胞增殖能力降低,但是与si-FUT8组相比,si-NC+SC79组细胞增殖能力增加。P＜0.05,见图5。

图5 CCK8实验检测SC79对转染FUT8 siRNA的结直肠癌细胞能力的影响Note.Compared with si-NC+SC79 group,*P＜0.05.Compared with si-FUT 8 group,#P＜0.05.The same as below.Figure 5 CCK8 experiment detected the effect of SC79 on the ability of colorectal cancer cells transfectedwith siRNA of FUT8

2.6 SC79对转染FUT8 siRNA的结直肠癌细胞侵袭能力的影响

采用Boyden实验检测SC79对转染FUT8 siRNA的结直肠癌细胞侵袭能力的影响,结果显示si-NC组、si-NC+SC79组、si-FUT8组和si-FUT8组+SC79组SW480细胞穿膜细胞数为(56.67±7.09)个、(25.33±1.53)个、(59.00±3.61)个和(33.33±3.79)个。si-NC组和si-NC+SC79组SW480细胞侵袭能力无差异,与si-NC组和si-NC+SC79组相比,si-FUT8组和si-FUT8组+SC79组细胞侵袭能力降低,但是与si-FUT8组相比,si-NC+SC79组细胞侵袭能力增加。P＜0.05,见图6。

图6 Boyden实验检测SC79对转染FUT8 siRNA的结直肠癌细胞侵袭能力的影响Figure 6 Boyden experiment detected the effect of SC79 on the invasion ability of colorectal cancer cells transfected with FUT8 siRNA

2.7 Western blot实验检测FUT8对AKT/βcatenin信号通路的影响

采用Western blot实验检测FUT8对结直肠癌细胞AKT/β-catenin信号通路的影响,结果显示si-NC组和si-NC+SC79组SW480细胞中pAKT和β-catenin蛋白的表达无显著性差异,与si-NC组和si-NC+SC79组相比,si-FUT8组和si-FUT8组+SC79组细胞中pAKT和β-catenin蛋白的表达降低,但是与si-FUT8组相比,si-NC+SC79组细胞中pAKT和β-catenin蛋白的表达增加。P＜0.05,见图7。

图7 Western blot实验检测FUT8对AKT/β-catenin信号通路的影响Figure 7 Western blot experiment detected the effect of FUT8 on AKT/β-catenin signaling pathway

3 讨论

结直肠癌是男性和女性中常见的消化系统恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康[10]。随着结肠镜检查的普及,结直肠癌的发病率和死亡率在过去的几十年中虽然有所下降,但是由于初次诊断时患者已处于晚期,手术切除、化学治疗、放射治疗和分子靶向等治疗对其疗效有限,导致结直肠癌患者的预后仍然很差[11]。结直肠是由癌基因、抑癌基因和与DNA修复机制相关的基因突变引起的[3]。转移和复发的频率高是导致结直肠癌患者死亡的主要原因[12-13]。因此研究结直肠癌细胞增殖和侵袭的分子机制对探索治疗结直肠癌新的分子靶点非常重要。

糖基化是寡糖链与蛋白质或脂质共价连接的过程,其在包括细胞生长、分化和转化等许多生理和病理变化中发挥重要作用[4]。岩藻糖基化是肿瘤中最重要的糖基化类型之一,与肿瘤的恶性转化、侵袭和转移有关。岩藻糖基化是由FUTs家族将岩藻糖转移到糖蛋白和糖脂中合成的,FUTs表达失调引起岩藻糖基异常化涉及肿瘤发生的各种基本细胞生物学过程[14]。FUTs家族包括13种成员,其中由FUT8编码的α1,6-岩藻糖基转移酶是唯一负责核心岩藻糖基化的酶,而核心岩藻糖基化对粘附分子和生长因子受体具有重要的调节功能,因此FUT8密切参与肿瘤细胞的恶性增殖和侵袭过程[15]。同时研究报道FUT8与实体肿瘤患者的预后相关,胰腺导管癌组织中高表达的FUT8蛋白与患者淋巴结转移和无复发生存率显着相关[16]。在结直肠癌组织中FUT8的表达对患者预后的影响与p53的状态有关,在p53阴性的晚期结直肠癌患者中FUT8蛋白的阳性表达与患者更好的无疾病进展生存期显著相关[9]。但是FUT8在结直肠癌中发挥的功能仍然未知。本文采用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)数据库分析显示FUT8在结直肠癌组织中的表达水平显著高于其在正常结直肠组织中的表达水平,提示FUT8在结直肠癌中发挥癌基因的作用,与FUT8在其它肿瘤中的表达情况具有一致性[6-8]。

本文采用siRNA转染结直肠癌细胞抑制FUT8的表达后,CCK8和Boyden实验检测结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力,结果显示干扰FUT8的表达抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力,表明FUT8在结直肠癌中高表达促进其增殖和侵袭。Tu等[6]报道抑制FUT8的表达则抑制了高侵袭性乳腺癌细胞的侵袭性。癌症相关成纤维细胞中FUT8的表达促进非小细胞肺癌的增殖和侵袭能力[17]。与本文中观察到FUT8的生物学功能一致。在乳腺癌中FUT8可能通过岩藻糖基化TGF-β受体复合物,以促进TGF-β结合并增强下游信号传导发挥促癌作用[6]。AKT、WNT和KRAS等信号途径的改变导致结直肠癌细胞增殖和迁移增加[18-19]。而在肝细胞肝癌中表达上调的FUT8通过激活PI3K-AKT-NFκB信号传导促进肝细胞肝癌细胞的增殖能力[8]。FUT8缺乏可以通过减少核β-catenin蛋白的积累抑制乳腺癌细胞的粘附、迁移和侵袭[20]。FUT8是否可以调控AKT/β-catenin信号通路促进结直肠癌的进展,本文采用一种可以增加AKT磷酸化水平的小分子化合物SC79处理FUT8 siRNA转染的结直肠癌细胞,功能实验检测SC79和FUT8 siRNA共同作用对结直肠癌细胞增殖和侵袭能力的影响,结果显示si-NC组与si-NC和SC79共同处理组细胞的增殖和侵袭能力无差异,表明在si-NC组细胞中AKT信号通路均为激活状态。而与si-NC组相比,si-FUT8和SC79处理组细胞的增殖和侵袭能力降低,但是高于si-FUT8组细胞的增殖和侵袭能力,表明在si-FUT8组细胞中AKT信号通路活性被抑制,且SC79仅能部分恢复AKT信号通路的活性。同时Western blot同样发现SC79可以减弱FUT8 siRNA对结直肠癌细胞中pAKT和β-catenin蛋白的抑制作用,表明FUT8通过调控AKT/β-catenin信号通路促进结直肠癌细胞增殖和侵袭能力。

综上所述,FUT8 siRNA可能通过调控AKT/βcatenin信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力,是结直肠癌候选癌基因,可能是治疗结直肠癌新的分子靶点。