艾曲波帕在IFN-γ介导的炎性环境中对造血干细胞衰竭的影响机制研究

王 娟，雷 秦，许世娟

（陕西省核工业二一五医院血液内科，咸阳 712000）

干扰素（interferon，IFN）是人类发现最早的一类细胞因子，其中IFN-γ是Ⅱ型IFN中唯一的亚型，其可有效促进细胞表面的MHCⅠ分子表达，提高人体的免疫监视能力，在临床应用上具有重要的价值[1-4]。有研究指出，IFN-γ 在贫血和获得性再生障碍中发挥着重要作用[5]，然而，IFN-γ 表达水平升高会导致血小板和中性粒细胞的减少[6]，从而影响机体造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSPCs）的产生、分化、维持、更新等过程[7-8]。研究认为，细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路能促进机体胚胎干细胞的造血分化[9]。ERK 信号通路的缺失会造成动脉发育不完全，不利于患者HSPCs 的正常增殖[10]。因此，ERK信号通路的控制与HSPCs 是否顺利产生具有显著的相关性。艾曲波帕是一种促进血小板新生激动剂。研究报道，艾曲波帕能够有效治疗慢性免疫性的血小板减少性患者[11]。但目前关于艾曲波帕在IFN-γ介导的炎性环境中对HSPCs的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨艾曲波帕对IFN-γ介导的炎性环境中调控ERK信号通路对HSPCs的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 重组人IFN-γ（货号：TL-105）购自北京同立海源生物科技有限公司；重组人血小板生成素注射液（特比澳）（国药准字S20050049）由沈阳三生制药有限责任公司提供；艾曲波帕（REVOLADE）由瑞士诺华公司提供。

1.2 细胞分组及处理 选取2018 年3 月至2019 年11月陕西省核工业二一五医院的15例健康志愿者，年龄18～55岁，所有志愿者均已签署实验知情同意书。本研究已取得机构审查委员会批准。通过髂前上棘骨髓穿刺取得受试者的HSPCs，培养至对数生长期，分为3 组：IFN-γ 组（加入100 μg/L IFN-γ 培养24 h）、艾曲波帕组（加入3 g/mL艾曲波帕含药血清培养24 h）、艾曲波帕+IFN-γ组（100 μg/L IFN-γ干预1 h后加入3 g/mL艾曲波帕含药血清培养24 h），每组设置6个复孔。

1.3 人CD34+HSPCs 的获取与鉴定 连续5 d，每天给予受试者皮下注射10 μg/kg粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor,g-CSF），于第6天分离白细胞，并使用Clinimacs Plus仪器富集CD34+HSPCs后冷冻保存。对分离出的细胞进行流式细胞仪分析，使用CD34+抗体检测调节性T 细胞CD34+。使用BD 流式细胞仪（BD 公司，美国）和Tree Star FlowJo分析软件分析调节性T细胞CD34+的数量。

1.4 RT-PCR 法检测转录激活因子1（ATF1）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、c-fos 和P27 mRNA表达 用Trizol试剂（上海碧云天公司）提取HSPCs 细胞RNA，逆转录为cDNA，用TaqMan Universal PCR kit在荧光定量PCR仪（美国赛默飞世尔科技公司，型号：ABI7500）上进行PCR 扩增。以GAPDH 为内参，Bandscan 5.0软件通过积分光密度值分析ATF1、CREB、c-fos 和P27 mRNA 相对表达量，采用2-△△t法计算目的基因mRNA 的相对表达量。引物由上海生工公司合成，引物序列如下：ATF1 上游：5’-CGCACGATATCTAGTGACAGAGG-3’，下游：5’-TGCAAACCTGTAGGGTAAAT-GG-3’；CREB上游：5’-TCAGCCGGGTACTACCATTC-3’，下游：5’-TCTCTTGCTGCTTCCCTG-3’；c-fos上游：5’-ACCAGCCCAGACCTGCAGTGG-3’，下游：5’-CCGGCACTTGGCTGCAGCCAT-3’；P27 上游：5’-GTCACGCGTATGTCAAACGAGTGTC-3’，下游：5’-ACCACTAGTTGACGTCTTCTGAGGCCAG-3’；GAPDH 上游：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游：5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’。

1.5 Western blotting 法检测ATF1、CREB、c-fos、P27 和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表达 取HSPCs，加入裂解液裂解细胞，BCA 法检测蛋白浓度，SDSPAGE 电泳分离蛋白，蛋白转移至PVDF 膜，脱脂奶粉封闭1 h，PBS 缓冲液漂洗3 次，一抗ATF1（1∶1 000；美国Sigma 公司，批号ASF000125）、CREB（1∶1 000；美国Sigma公司，批号BNO009587）、c-fos（1∶1 000，上海碧云天公司，批号2019-005247）、P27（1∶1 000，上海碧云天公司，批号2019-000957）、ERK（1∶1 000，上海碧云天公司，批号2019-0124450）和p-ERK 抗体（1∶1 000，美国Sigma 公司，批号BGC010248）4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，采用辣根酶标记标记的羊抗小鼠IgG（1∶5 000，美国Pierce公司，批号AB00987）室温孵育2 h，PBS 缓冲液漂洗3 次。DBA 显色，并于化学发光成像仪上进行成像并拍照。各组细胞p-ERK 水平的检测时间点为作用12 h或24 h。采用Image J 6.0分析蛋白条带灰度值。计算目的蛋白相对表达量（相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值×100%）。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件分析数据；计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 艾曲波帕在IFN-γ介导的炎症环境下对HSPCs的影响 艾曲波帕+IFN-γ 组CD34+细胞百分比为（50.22±3.10）%，显著高于IFN-γ组的（30.17±2.13）%，显著低于艾曲波帕组的（88.49±3.89）%（均P＜0.05）。

2.2 3组细胞p-ERK 相对表达量比较 作用12 h后，与IFN-γ组和艾曲波帕组比较，艾曲波帕+IFN-γ组细胞p-ERK均显著升高（P＜0.05），而IFN-γ组和艾曲波帕组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；作用24 h 后，与IFN-γ 组比较，艾曲波帕组和艾曲波帕+IFN-γ 组细胞p-ERK 表达水平均显著升高，艾曲波帕+IFN-γ组则较艾曲波帕组显著升高（P＜0.05），见表1、图1。

图1 Western blotting法检测p-ERK蛋白表达

表1 3组细胞p-ERK相对表达量比较%， ，n=5

表1 3组细胞p-ERK相对表达量比较%， ，n=5

与IFN-γ组比较，aP＜0.05；与艾曲波帕组比较，bP＜0.05。

2.3 3组细胞ATF1、CREB、c-fos 和P27 mRNA 相对表达量比较 与IFN-γ 组比较，艾曲波帕组和艾曲波帕+IFN-γ组ATF1、CREB和P27 mRNA相对表达量均显著升高，而c-fos 相对表达量显著降低（均P＜0.05）；与艾曲波帕组比较，艾曲波帕+IFN-γ 组ATF1、CREB和P27 mRNA相对表达量均显著降低，而c-fos 相对表达量显著升高（均P＜0.05），见表2。

表2 3组细胞ATF1、CREB、c-fos和P27 mRNA相对表达量比较

2.4 3组细胞ATF1、CREB、c-fos和P27 蛋白表达量比较 与IFN-γ 组比较，艾曲波帕组和艾曲波帕+IFN-γ 组ATF1、CREB 和P27 蛋白相对表达量均显著升高，而c-fos相对表达量显著降低（P＜0.05）；与艾曲波帕组比较，艾曲波帕+IFN-γ 组ATF1、CREB和P27 蛋白相对表达量均显著降低，而c-fos相对表达量显著升高（P＜0.05），见图2、表3。

表3 3组细胞ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表达量比较%，

表3 3组细胞ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表达量比较%，

与IFN-γ组比较，aP＜0.05；与艾曲波帕组比较，bP＜0.05。

图2 Western blotting法检测ATF1、CREB、c-fos和P27蛋白表达

3 讨论

艾曲波帕片（REVOLADE）是一种促血小板生成素受体激动剂适用于治疗慢性免疫性血小板减少性紫癜患者的血小板减少，对皮质激素、免疫球蛋白或脾切除反应不佳的患者。近年来，众多实验室研究证实艾曲波帕可通过刺激机体HSPCs 的增殖诱导免疫耐受及免疫调节等过程，从而促进机体系统造血功能恢复[12]。IFN-γ 是一种具有免疫和炎症的有效性介质，其在机体炎症诱导反应中，在贫血和获得性再生障碍中发挥着重要作用[13]。研究显示：造血过程中众多信号调控通路之间存在着一定的相互作用，对机体HSPCs 的增殖、分化和更新等过程具有严密的调控机制[14-17]。本研究探究艾曲波帕在IFN-γ介导的炎性环境中对HSPCs衰竭的影响机制。

近年来研究发现，艾曲波帕能够在IFN-γ 的作用下激活机体CMPL 通路[18]。研究发现，艾曲波帕对骨髓衰竭患者中，亦具有一定的治疗作用，包括自身免疫疾病或慢性感染等，而其与重组人血小板生成素（rhTPO）的比较中发现，rhTPO 能够对PIK13/AKT、JAK2/STST-1信号通路具有传导作用，而艾曲波帕仅能激活JAK2/STAT-1 信号通路，认为rhTPO可有效促进血小板聚集，艾曲波帕无此功能，可能原因与CMPL 的氨基酸序列位点不同相关[19-20]。研究显示：在敲除STAT5a和5b的小鼠模型中，STAT 可与和DNA 结合并促使受损机体内血小板的产生，证实JAK/STAT 通路和血小板的产生相关[21]。而当机体内Ras 通路被激活后，可进一步激活ERK通路，进而导致p90rsK磷酸化，促进ERK下游多种因子ATF1、CREB磷酸化和c-fos转录[22]。

艾曲波帕不仅可促使巨核细胞的增殖、分化，促进血小板的生成，还有促进骨髓HSPCs的增殖和分化，从而改善造血功能的作用，故批准用于治疗经免疫抑制疗法无效的重型再生障碍性贫血患者。艾曲波帕可能通过以下4 种机制在AA 治疗中发挥作用：刺激并维持HSPCs，减少IFN 对HSPCs的抑制；促进免疫耐受，抑制巨噬细胞活性、削弱树突状细胞成熟、增加调节性B 细胞及调节性T 细胞数量；免疫调节，进而减少IFN及TNF的释放、增加转化生长因子（TGF）释放；还有一点的疗效验证是铁清除，可以促使细胞铁动员、减少铁过载的现象。结合本研究结果笔者推测，艾曲波帕可在促炎细胞因子IFN-γ介导的炎症环境中防止人类HSPCs和祖细胞衰竭，其机制与ERK通路激活下游多种蛋白激酶的表达密切相关。在免疫介导的骨髓衰竭综合征中，促炎细胞因子IFN-γ 参与人类HSPCs 和祖细胞的耗竭。IFN-γ复合物形成紊乱以及所导致的生长因子细胞信号的重要通路抑制或可代表IFN-γ损害人HPSCs功能的一般机制。这一发现或可为各类慢性炎性疾病提供广泛的治疗应用。

综上所述，艾曲波帕能在IFN-γ 介导的炎症环境中，通过ERK通路激活下游多种蛋白激酶的表达水平，达到防止HSPCs衰竭的作用。