miR-378a对高糖介导胰岛β细胞损伤的影响*

陈朝琴，薛治乾，李文霞△

（儋州市人民医院 1.内分泌科2.病理科，儋州 571700）

2 型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）是一种常见的慢性代谢性疾病，随着人们生活方式的改变以及我国人口老龄化，T2D 的发病率逐年升高[1]。根据国际糖尿病联合会的统计，2011年全球糖尿病患者数量达到3.7 亿，到2030 年这一数字将接近5.5亿[2]。高血糖、胰岛素抵抗和β细胞功能受损构成了T2D 的病理基础。高血糖会导致β 细胞功能异常，引起胰岛素分泌受损和胰岛β 细胞凋亡增加等[3]。因此，糖毒性在T2DM 的发病机理中具有重要作用。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一种短的非编码调控RNA 分子，已成为基因调控的重要参与者，并且对糖尿病的治疗过程具有重大影响[4]。研究表明，miRNA 是脂质和葡萄糖代谢的关键调节剂，并且通过影响肝脏、脂肪组织和胰腺的状态和功能，在代谢疾病的发病机理中发挥关键作用[5-6]。此外，据报道，许多miRNA参与胰腺发育，并在胰岛素抵抗个体的胰岛素分泌和β细胞分化转录中起转录后调控作用[7-8]。因此，miRNA有望成为糖尿病的治疗新靶点。最近的研究认为，miR-378a是体内能量和葡萄糖稳态的重要调节剂，是改善代谢失调的潜在靶标[9]。但是，miR-378a 是否参与糖毒性诱导的胰岛β细胞损伤仍不清楚。本实验探讨miR-378a对高糖介导胰岛β 细胞损伤的影响，为T2D 临床防治和治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

大鼠胰岛β 细胞INS-1（美国ATCC）；RPMI 1640 培养基、胎牛血清（美国Gibco）；miR-378a inhibitors 及inhibitors control（上海吉玛生物）；Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂（美国Invitrogen）；RNA 提取试剂盒、ECL 超敏化学发光试剂（赛默飞世尔）；逆转录试剂盒、SYBR Green 实时荧光定量PCR 检测试剂盒（日本TOYOBO）；MTT 试剂、DCFH-DA荧光探针、BCA蛋白浓度检测试剂盒（美国Sigma）；LDH 和MDA 检测试剂盒（南京建成生物）；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（日本TaKaRa）；胰岛素检测试剂盒（上海纪宁生物）；Cleaved Caspase 3 单抗（美国Abcam）；HRP 标记的IgG（美国CST）。

1.2 细胞培养和分组

INS-1 细胞培养在含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640 培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱进行常规培养，每隔1 d 更换1 次新的培养液，取对数生长期的INS-1 细胞以不同的处理方式进行分组：Con组（采用完全培养基培养的INS-1细胞）、HG组（采用25 mmol/L 高糖培养基培养的INS-1 细胞）、HG+anti-miR-NC组（采用25 mmol/L高糖培养基培养的INS-1细胞+转染inhibitors control）和HG+antimiR-378a 组（采用25 mmol/L 高糖培养基培养的INS-1 细胞+转染miR-378a inhibitors）。采用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂进行转染，具体步骤参照转染试剂使用说明操作，其中inhibitors control和miR-378a inhibitors 的转染浓度均为100 nmol/L。以上各组INS-1细胞处理后于37 ℃培养箱继续孵育，48 h 后分别收集各组INS-1 细胞及上清培养液进行相关指标的检测。

1.3 实时荧光定量PCR（qPCR）技术测定细胞中miR-378a的相对表达量

各组INS-1 细胞处理48 h 后，分别收集各组INS-1细胞，加入适量TRIzol试剂分别提取总RNA，取2 μL RNA 样品检测RNA 的纯度和浓度，合格的RNA 进行逆转录合成cDNA，获得的cDNA 为模板链，U6为内参，采用SYBR Green实时荧光定量PCR检测试剂盒进行扩增，检测miR-378a 的相对表达量。miR-378a 引物（上游5’-GGGCACTGGACTTGGAGTC-3’，下游5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’）；U6（上游5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’）。扩增程序设为：94 ℃5 min，随后设40 个循环，每个循环94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s。待反应结束后根据样本的Ct值，采用2-△△Ct法分析各组INS-1细胞中miR-378a的相对表达量。

1.4 MTT实验检测细胞活力

生长良好的INS-1 细胞以1×105个/mL 的密度接种于96孔板内，按照“1.2”项进行分组处理，同时设置调零孔，48 h后分别向每孔细胞中加入MTT溶液100 μL，37 ℃培养箱继续孵育4 h，取出细胞，去细胞培养液，再向细胞中加入150 μL 二甲基亚砜，于震荡仪上振荡10 min，待结晶沉淀全部溶解后，调整多功能酶标仪波长至450 nm，测定各组INS-1 细胞的吸光度值（A 值），将对照组INS-1 细胞活力记为100%，分别计算其余各组INS-1细胞的活力。

1.5 DCFH-DA荧光探针法检测ROS水平

INS-1 细胞接种到6 孔板中，按照“1.2”项的方法分组处理48 h 后，除去上清培养液，向细胞中加入含DCFH-DA 荧光探针的无血清培养液，于37 ℃培养箱避光培养30 min，期间轻柔晃动2次，取出细胞培养板，以PBS洗涤细胞，除去探针和培养液，加入适量PBS重悬细胞，使用流式细胞仪在激发波长488 nm，发射波长525 nm 处分析荧光强度，以荧光强度表示ROS水平。

1.6 LDH和MDA含量检测

INS-1 细胞分组处理48 h 后，分别收集细胞上清培养液，除去细胞碎片，使用LDH和MDA含量检测试剂盒分别测定上清液中LDH 和MDA 含量，具体步骤参考试剂盒使用说明。

1.7 ELISA实验检测细胞分泌胰岛素水平

INS-1细胞分组处理48 h后，收集细胞上清液，参照ELISA检测试剂盒说明书分析各组INS-1细胞分泌胰岛素水平，具体操作步骤严格参照胰岛素检测试剂盒说明书进行。

1.8 流式细胞术测定细胞凋亡情况

收集处理48 h后的4组INS-1细胞，PBS洗涤细胞3次，向细胞中加入适量结合缓冲液，制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，再加入AnnexinⅤ-FITC和PI 染液各5 μL，轻轻混匀，室温下避光染色15 min，加入结合缓冲液后立即用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.9 Western blotting 实验检测Cleaved Caspase 3蛋白表达

INS-1 细胞分组处理结束后，去上清培养液，PBS洗涤数次，加入适量细胞裂解液，冰上裂解细胞并提取总蛋白，使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，取30 μg 蛋白上样，配制10%的SDSPAGE 凝胶，电泳分离蛋白并电转至PVDF 膜上，在含5%脱脂奶粉封闭液中封阻2 h，洗膜后加入稀释的一抗（1∶800稀释），4 ℃过夜孵育，取出膜后洗膜，再加入1∶3 000稀释的二抗，室温反应2 h，洗膜后滴加ECL 化学发光试剂，显影、定影，曝光并采集图像，使用Image J 软件分析各组INS-1 细胞中Cleaved Caspase 3 蛋白相对表达水平，以Cleaved Caspase 3蛋白条带灰度值与GAPDH灰度值的比值表示。

1.10 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组INS-1细胞中miR-378a表达情况比较

与Con组相比，HG组INS-1细胞中miR-378a的表达量明显升高（P＜0.05），细胞活力明显降低（P＜0.05）；与HG 组相比，HG+anti-miR-378a 组INS-1 细胞中miR-378a 的表达量明显降低（P＜0.05），细胞活力明显升高（P＜0.05），而HG+antimiR-NC组中miR-378a的表达量和细胞活力无显著改变（P＞0.05），见表1。提示高糖刺激能够促进胰岛β 细胞中miR-378a 的表达，而转染miR-378a inhibitors 能够有效抑制高糖刺激的miR-378a 的表达升高，且高糖刺激能够抑制胰岛β细胞活力，而抑制miR-378a能够逆转高糖刺激引起的细胞活力降低。

表1 各组INS-1细胞miR-378a相对表达量和细胞活力比较 ，n=3

表1 各组INS-1细胞miR-378a相对表达量和细胞活力比较 ，n=3

与Con组比较，*P＜0.05；与HG组比较，&P＜0.05。

2.2 各组INS-1细胞氧化损伤情况比较

与Con组相比，HG组INS-1细胞内ROS水平明显升高，LDH 漏出量和上清液中MDA 含量明显增多（P＜0.05）；与HG 组相比，HG+anti-miR-378a 组INS-1 细胞内ROS 水平明显降低，LDH 漏出量和上清液中MDA 含量明显减少（P＜0.05），而HG+antimiR-NC组ROS水平、LDH漏出量及上清液中MDA含量均无明显改变（P＞0.05），见表2。提示高糖刺激能够引起胰岛β 细胞氧化损伤，而抑制miR-378a能够减轻高糖引起的胰岛β细胞的氧化损伤。

表2 各组INS-1细胞内ROS水平及上清液中LDH 和MDA的含量比较 ，n=3

表2 各组INS-1细胞内ROS水平及上清液中LDH 和MDA的含量比较 ，n=3

与Con组比较，*P＜0.05；与HG组比较，&P＜0.05。

2.3 各组INS-1细胞分泌胰岛素水平比较

与Con组相比，HG组INS-1细胞中胰岛素水平明显降低（P＜0.05）；与HG 组相比，HG+anti-miR-378a 组INS-1 细胞中胰岛素水平明显升高（P＜0.05），而HG+anti-miR-NC 组中胰岛素水平无明显改变（P＞0.05），见表3。提示高糖刺激能够抑制胰岛β细胞分泌胰岛素，而抑制miR-378a能够逆转高糖刺激对胰岛β细胞分泌胰岛素的抑制作用。

表3 各组INS-1细胞胰岛素水平比较 ，n=3

表3 各组INS-1细胞胰岛素水平比较 ，n=3

与Con组比较，*P＜0.05；与HG组比较，&P＜0.05。

2.4 各组INS-1细胞凋亡情况比较

与Con 组相比，HG 组INS-1细胞凋亡率和Cleaved Caspase 3 的表达水平均明显升高（P＜0.05）；与HG组相比，HG+anti-miR-378a组INS-1细胞凋亡率和Cleaved Caspase 3的表达水平均明显降低（P＜0.05），而HG+anti-miR-NC 组细胞凋亡率和Cleaved Caspase 3 的表达水平均无明显改变（P＞0.05），见图1和表4。表明高糖刺激能够促进胰岛β细胞凋亡，而抑制miR-378a能够逆转高糖刺激对胰岛β细胞凋亡促进作用。

图1 miR-378a介导高糖刺激对胰岛β细胞凋亡的影响

表4 各组INS-1 细胞凋亡率和Cleaved Caspase 3 的表达水平比较 ，n=3

表4 各组INS-1 细胞凋亡率和Cleaved Caspase 3 的表达水平比较 ，n=3

与Con组比较，*P＜0.05；与HG组比较，&P＜0.05。

3 讨论

据估计，2015年全球有超过4.15亿人患有糖尿病，其发病率和死亡率不断增加[10]。所有糖尿病病例中约95%为T2D。T2D 是一种以胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷为特征的代谢紊乱疾病[11]。实验报告称，β 细胞的损伤是糖尿病的重要病理基础。营养对于维持β细胞功能至关重要，但是，过多的营养素（例如葡萄糖）会诱导对β 细胞功能的损伤[12-13]。LDH含量的高低在一定程度上反应细胞膜的完整性，LDH漏出量越高表明细胞损伤程度越严重。氧化应激在糖尿病的发生和发展中起关键作用，它可以通过检测细胞内ROS的产生，MDA水平和SOD活性来评估。在本研究中，高浓度的葡萄糖培养液孵育胰岛β 细胞INS-1能够显著降低细胞活力，增加细胞凋亡率，提高细胞内ROS 水平，增加LDH 的漏出量及上清液中MDA 的含量，降低胰岛素分泌水平，提示高糖能够抑制胰岛β细胞活力，促进细胞凋亡，引起细胞氧化损伤并阻碍胰岛素的分泌。这些研究结果与以往研究相符，表明高糖刺激能够诱发胰岛β细胞发生损伤。

miRNA 是一组内源性非编码小RNA，长度在21至23个核苷酸之间，是转录后基因表达的关键调控因子。研究表明，miRNA 与T2D 的发病机理有关[14]。更重要的是，miRNA可通过影响胰腺调节脂质和葡萄糖代谢的状态和功能，在代谢疾病的发病机制中发挥关键作用[15-16]。在miRNA 中，据报道miR-378a 在调节葡萄糖代谢中发挥重要作用[17]。Sud等[19]在对高果糖饮食改变的miRNA进行了全面研究，发现包括miR-378a 在内的多种miRNA 在慢性代谢疾病发病机理中的重要性[18]。Mo 等[18]研究发现，降糖消渴颗粒治疗能够降低糖尿病小鼠胰腺组织中miR-378a 表达，进而发挥抗糖尿病的作用。最近的研究表明，miR-378a参与胰岛素抵抗的发病机理，对β细胞功能非常重要。但是，尚未完全了解miR-378a对高糖诱导的糖毒性的确切作用。因此，本实验检测了高糖刺激的胰岛β 细胞中miR-378a的表达，结果发现，高糖能够促进miR-378a的表达，提示miR-378a 可能参与高糖刺激对胰岛β 细胞的损伤。此外，本实验结果发现，抑制miR-378a 能够明显减少高糖诱导的INS-1 细胞凋亡，减轻氧化损伤，提高胰岛素分泌水平。表明miR-378a 可保护INS-1细胞免受高糖诱导的糖毒性。以往大量研究显示，miRNA通常是通过调控下游靶基因的表达从而发挥生物学功能，且已有多篇文献报道了miR-378a 在肿瘤、新陈代谢、线粒体和自噬中的生物学功能和作用机制[20-22]。miR-378a对高糖刺激的INS-1细胞的保护作用可能通过靶向下游基因或信号通路发挥作用，后续研究将对此进行探究。

综上，高糖刺激能够促进INS-1 细胞中miR-378a 的表达，抑制miR-378a 能够逆转高糖刺激对INS-1细胞的损伤，减轻氧化损伤和凋亡。