miRNA-337调控JAK2/STAT3通路对人肺腺癌细胞PG49增殖和迁移的影响*

李雅菲，张 燕，董清科，汪代杰

（四川省泸州市人民医院肿瘤科，泸州 646000）

肺癌是临床常见的恶性肿瘤，是由吸烟、环境和遗传因素之间相互作用引起的，根据肺癌的组织学类别，其可分为肺腺癌、小细胞肺癌、大细胞肺癌和鳞状细胞肺癌，其中肺腺癌的发病率最高[1-2]。目前临床对肺腺癌的治疗效果不理想，大多数患者确诊时已处于晚期或已发生不同程度的局部浸润或转移，失去手术治疗的机会，而即使采用放疗、化疗等治疗方法，晚期患者生存率仍然较低[3-4]。因此，对肺腺癌发病的分子机制深入研究，寻找新的治疗靶点至关重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是内源性小分子非编码RNA，调控靶基因的转录和翻译，在包括肺癌等多种肿瘤细胞中异常表达，参与细胞增殖、迁移等生物学过程[5]。研究发现，miR-337在肺癌组织中低表达，上调miR-337表达水平可显著抑制肺癌的发生[6]，但其具体机制尚未完全清楚。因此，本研究旨在观察miR-337对PG49人肺腺癌细胞增殖和迁移能力的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人正常肺上皮细胞BEAS-2B（货号H084）购自上海舜冉生物科技有限公司；人肺腺癌PG49 细胞（货号Y-02117）购自上海富恒生物科技有限公司。miR-337 mimic 慢病毒（LVmiR-337 mimic）、miR-337 阴性对照（NC）慢病毒空载体（LV-NC）由上海吉凯基因有限公司设计并合成；实时荧光定量PCR（qPCR）引物由上海吉玛生物公司设计合成；PCR试剂盒（货号14966005）购自美国ThermoFisher 公司；反转录试剂盒（货号K1622）购自美国Fermentas 公司；Trizol（货号46301）购自美国Sigma 公司；兔抗人单克隆Ki67 抗体（货号ab92742)、鼠抗人单克隆E-钙粘蛋白（E-cadherin）抗体（货号ab11512）、兔抗人多克隆基质金属蛋白酶9（MMP-9）抗体（货号ab97779)均购自英国Abcam公司；鼠抗人单克隆信号转导及转录活化因子3（STAT3）抗体（货号9139）、兔抗人单克隆p-STAT3抗体（货号9145）、鼠抗人单克隆Janus 激酶2（JAK2）抗体（货号74987）、兔抗人多克隆p-JAK2抗体（货号3771）均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养 BEAS-2B 和PG49 细胞用RPMI-1640 培养基（含10%FBS、100µg/mL 链霉素和100 U/mL青霉素），置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中常规培养。隔天换液，待细胞融合度达到80%时用0.25%腺酶消化、传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染和分组 将PG49细胞以1×106个/mL细胞密度接种于24 孔板，每孔200 μL，分为空白对照组（不转染）、LV-NC 组和LV-miR-337 mimic 组，另以BEAS-2B细胞作为正常组，每组8个复孔。取2 支EP 管，分别加入200 μL 完全培养基，LV-NC 组和LV-miR-337 mimic 组分别加入24 μL 浓度为1×108TU/mL 慢病毒空载体和慢病毒液（转染复数MOI值为60），混合均匀后各加入4 μL浓度为6 μg/mL 聚凝胺。正常组、空白对照组均加入228 μL PBS。各组细胞均置于培养箱中培养12 h 后，更换新鲜完全培养基继续培养。

1.4 qPCR 法检测人肺腺癌PG49 细胞miRNA-337表达 细胞转染48 h 后，Trizol 法提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度和纯度，将RNA 转录为cDNA，用实时荧光定量PCR 仪（ABI 9700）进行PCR 扩增，PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共40个循环。采用2－△△Ct法计算miRNA-337 相对表达量。采用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列如下：miR-337上游：5’-CGCTTCAGCTCCTATATGA-3’，下游：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；内参U6 上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 CCK8 法检测细胞增殖 以2×104个/mL 细胞密度接种于96孔板，每孔200 μL，分别在24 h、48 h、72 h 加入CKK8 试剂，按照CKK8 试剂盒说明书进行操作，用酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸光度（OD）值。细胞增殖率=转染组OD 值/空白对照组OD值×100%。

1.6 Transwell实验检测人肺腺癌PG49细胞侵袭

细胞转染48 h 后，调整细胞密度为1×105个/mL，在Transwell 小室下层加入10% FBS 培养基500 μL，上层加入100 μL 细胞悬液，每组设8 个复孔，培养24 h后，取出小室，用棉签擦去基质胶和上室细胞，预冷甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色40 min。弃上、下室培养基，在倒置相差显微镜下随机选取5个视野，统计穿膜细胞数，计算侵袭率。侵袭率=实验组穿膜细胞数/空白对照组穿膜细胞数×100%。

1.7 细胞划痕实验检测人肺腺癌PG49细胞迁移

细胞转染48 h，收集各组细胞调整密度为2.5×105个/mL，每孔2 mL 接种于6 孔板，用200 μL 无菌枪头于6 孔板底部垂直划痕，确保每个孔内划痕宽度一致，PBS清洗3次，继续培养12 h、24 h、48 h，显微镜下观察、拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率＝（0 h划痕区域宽度－拍照时间划痕区域宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.8 Western blotting法检测JAK2/STAT3通路、Ki-67、MMP-9、E-cadherin 蛋白表达 细胞转染48 h后，PBS 清洗，加入含PMSF 的RIPA 裂解液置冰上裂解10 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，提取蛋白，BCA 法测定各组蛋白浓度，按4∶1 体积比加入5×上样缓冲液，煮沸使蛋白变性，预先制备6%分离胶和5%浓缩胶，取30 μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，加入一抗JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Ki-67、MMP-9、E-cadherin（均1∶500）4 ℃冰箱孵育过夜，TBST清洗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000，兰州维科生物工程有限责任公司），室温孵育2 h，TBST 清洗，ECL 发光、曝光、显影。采用Image J 软件对条带灰度值进行分析。

1.9 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组细胞miR-337相对表达量比较 与正常组（1.20±0.29）比较，空白对照组miR-337 相对表达量（0.78±0.25）、LV-NC 组miR-337 相对表达量（0.77±0.24）均显著降低（P＜0.05）；与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-337 mimic 组miR-337 相对表达量（1.59±0.31）显著升高（P＜0.05）。

2.2 过表达miR-337对人肺腺癌PG49细胞增殖的影响 与空白对照组、LV-NC 组比较，LV-miR-337 mimic组细胞增殖率显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 3组人肺腺癌PG49细胞增殖率比较

表1 3组人肺腺癌PG49细胞增殖率比较

与空白对照组比较，*P＜0.05；与LV-NC组比较，#P＜0.05。

2.3 过表达miR-337对人肺腺癌PG49细胞侵袭能力的影响 与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-337 mimic组细胞侵袭率显著降低（P＜0.05），见图1、表2。

表2 3组人肺腺癌PG49细胞侵袭能力比较

表2 3组人肺腺癌PG49细胞侵袭能力比较

与空白对照组比较，*P＜0.05；与LV-NC组比较，#P＜0.05。

图1 各组人肺腺癌PG49细胞的细胞侵袭情况（200×）

2.4 过表达miR-337对人肺腺癌PG49细胞迁移率的影响 与空白对照组比较、LV-NC 组比较，LVmiR-337 mimic 组细胞迁移率显著降低（P＜0.05），见图2、表3。

表3 3组人肺腺癌PG49细胞迁移率比较

表3 3组人肺腺癌PG49细胞迁移率比较

与空白对照组比较，*P＜0.05；与LV-NC组比较，#P＜0.05。

图2 各组人肺腺癌PG49细胞迁移情况（200×）

2.5 过表达miR-337 对PG49 细 胞p-JAK2、p-STAT3、Ki-67、MMP-9、E-cadherin蛋白表达的影响 与空白对照组、LV-NC 组比较，LV-miR-337 mimic组细胞p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值及Ki-67、MMP-9蛋白表达量均显著降低（均P＜0.05），而E-cadherin蛋白表达量显著升高（P＜0.05），见图3、表4。

图3 Western blotting蛋白电泳图

表4 3组PG49细胞Ki-67、MMP-9、E-cadherin、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达量比较

表4 3组PG49细胞Ki-67、MMP-9、E-cadherin、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达量比较

与空白对照组比较，*P＜0.05；与LV-NC组比较，#P＜0.05。

3 讨论

肺腺癌是肺癌常见的分型，近年来肺腺癌的发病率和死亡率呈上升的趋势，该病早期特征不明显，癌细胞易转移和复发，预后情况不理想，近年来肺腺癌的研究重点已从传统治疗转向肿瘤分子特性的靶向治疗[7-8]。miRNA 是一类长度约为18～22个核苷酸分子的非编码RNA，可与靶基因特定位点结合，调节约60%人类蛋白编码基因，大量研究表明，人类癌症的发生与miRNA 异常表达密切相关[9]。miR-337 位于14q32.2 号染色体，研究显示，miR-337 在肺癌组织中表达降低，其异常表达与肺癌的发生有关[6,10]。本研究通过qPCR对人正常肺上皮细胞BEAS-2B 和人肺腺癌PG49 细胞进行检测，发现与正常组比较，空白对照组、LV-NC 组细胞中miR-337相对表达量显著降低（P＜0.05），表明miR-337在人肺腺癌PG49细胞中低表达，可能作为抑癌基因参与肺腺癌发生发展。为进一步探究miR-337的作用，本研究采用miR-337 mimic 转染人肺腺癌PG49 细胞，结果发现，与空白对照组、LV-NC 组比较，LV-miR-337 mimic 组细胞中miR-337 相对表达量显著升高（P＜0.05），提示miR-337过表达模型建立成功。

细胞增殖、侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是影响患者预后的重要原因之一。Ki-67 是影响细胞增殖密切相关的核蛋白，在细胞周期中可被检测到，目前已广泛用于细胞增殖活性的标记蛋白[11]。细胞外基质和基底膜的降解主要由MMPs参与，MMP-9 作为MMPs 家族的重要成员，可降解细胞基底膜中的Ⅳ型胶原，在肿瘤细胞的侵袭和迁移中具有重要作用[12]。E-cadherin 可介导细胞间相互粘附，稳定细胞骨架，维持细胞形态和运动，在细胞粘附和运动中起重要作用，肿瘤细胞中E-cadherin表达下调有利于细胞发生侵袭迁移[13]。研究发现，miRNA-337通过直接靶向特异性蛋白1抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭[14]；Zhuang 等[15]研究表明，MiR-337-3p高表达可抑制肾癌细胞增殖、集落生长和侵袭，增强细胞粘附；Cao[16]研究表明，miR-337-3p 在宫颈癌中表达下调，上调miR-337-3p可能抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。本研究发现，与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-337 mimic 组PG49 细胞的相对增殖率、侵袭率、迁移率及Ki-67、MMP-9 蛋白相对表达量显著降低，而Ecadherin 蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05），提示miR-337 过表达可下调Ki-67、MMP-9 表达，上调Ecadherin 的表达，进而抑制人肺腺癌PG49 细胞增殖、迁移及侵袭。

JAK2/STAT3 信号通路可参与细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学过程。JAK2 被磷酸化后发生活化，可催化STAT3 磷酸化活化，促进p-STAT3 由细胞质进入细胞核，与靶基因特定的DNA启动子结合，从而调节下游Ki-67、MMP9、E-cadherin 等基因表达，调控细胞增殖、迁移、侵袭等生物学过程[17-18]。Wei 等[19]研究发现，miR-375 可靶向调控JAK2/STAT3 信号通路抑制结肠癌细胞的增殖。Zuo等[20]研究显示，miR-337-3p通过靶向JAK2调节JAK2/STAT3 信号通路抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。Xia等[21]研究表明，miR-337过表达可使皮肤T 细胞淋巴瘤细胞增殖减少，凋亡水平增加。而目前关于miR-337在人肺腺癌中相关研究较少。本研究发现，与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-337 mimic 组PG49 细胞中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.05），提示miR-337过表达可抑制JAK2和STAT3磷酸化，抑制JAK2/STAT3信号通路活化。

综上所述，miR-337可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路，抑制人肺腺癌PG49 细胞的增殖、迁移，可能为临床治疗人肺腺癌提供新思路。本研究的不足之处在于miR-337 调节人肺腺癌PG49 细胞的增殖、迁移的抑制作用机制可能涉及其他通路，具体机制尚不清楚，有待进一步研究。