姜黄素对CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠调节机制*

卢 丹，陈 琴，易和平

（1.鄂州市中心医院急诊科，鄂州 436000；2.三峡大学第二人民医院急诊科，宜昌 443005；3.武汉科技大学附属医院急诊科，武汉 430000）

心肌炎为一种致病原因复杂的疾病，病毒、细菌、真菌或支原体都能引起急性或慢性心肌炎症。其中，以病毒性心肌炎最为常见[1]。科萨奇病毒（coxsackie virus,CV）为一种肠病毒，可分为A、B两类，主要经呼吸道和消化道感染人体。可引起病毒性心肌炎、心律失常、慢性肾炎及慢性疲劳综合征等。科萨奇病毒B 组3 型（coxsackievirus type B3,CVB3）被证实是引起病毒性心肌炎的主要病原体，造成患者心肌炎和扩张性心肌病，严重者可致猝死[2]。目前针对CVB3的治疗尚无特效药物，但关于抗CVB3的有效中药成分报道日益增多。姜黄素是提取于姜黄和郁金等姜黄属植物根茎的含酚基和醌基的天然药物，中医认为其可行气活血，通经止痛[3]。研究表明，姜黄素具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、抗氧化应激以及神经保护等[4-5]。有报道证实，姜黄素可通过抑制心肌组织炎症反应以及增强心肌自噬活性等，改善自身免疫性心肌炎大鼠的心功能[6-7]。但姜黄素是否能通过调控炎症因子或细胞凋亡对病毒性心肌炎发挥一定的药理活性还鲜有报道。因此，本研究探究姜黄素对CVB3 诱导的病毒性心肌炎的防治效果，为病毒性心肌炎的临床治疗提供潜在候选药物。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

姜黄素（纯度≥95%）购自美国Sigma-Aldrich公司；环孢素软胶囊（国药准字H10960009）购自华北制药公司；CVB3 病毒购自武汉大学病毒研究所；MEM Eagle 培养基购自美国Thermo Fisher 公司；4%多聚甲醛购自国药集团；苏木素和伊红染液购自武汉谷歌生物公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肌酸激酶同工酶-MB（creatine kinase-MB Isoenzyme,CKMB）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性检测试剂盒均购自南京建成；NF-κB p65一抗（货号：8242）、Cleaved caspase-3 一抗（货号：9661）、iNOS一抗（货号：13120）均购自美国CST公司。

动物手术台购自浙江大学动物仪器厂；JJ-12J型脱水机和JB-P5 型包埋机购自武汉俊杰公司；DY89-I 型电动匀浆机购自宁波新芝科器研究所；RT 6000 酶标仪购自美国Rayto 公司；ALLC-10.4 型电子天平购自上海精密科学仪器公司；TDL-40B型离心机购自上海安亭科学仪器厂；D37520型低温高速离心机购自Heraeus公司；ECLIPSE 80i型荧光显微镜购自Nikon公司。

1.2 实验动物

3～4 周龄SPF 级雄性Balb/c 小鼠70 只[许可证号：SYXK（京）2019-0052]，体重（12±2）g，购自北京科兴中维生物公司。本实验涉及到的小鼠经过动物伦理委员会批准，且遵循动物实验减少（Reduction）、优化（Refinement）和替代（Replacement）的3R原则。

1.3 模型构建及分组给药

CVB3 感染诱导心肌炎小鼠模型构建：雄性Balb/c 小鼠共70 只于实验室适应性喂养一周后用于实验，随机抽取10 只小鼠作为空白对照组，剩下60 只小鼠用于病毒感染诱导心肌炎模型构建。根据文献[8]，采用10-5浓度TCID50的病毒小鼠腹腔注射100 μL，空白组注射病毒稀释液MEM Eagle 100 μL。分别于第7 和14 天补充注射病毒150 μL。于末次病毒注射次日随机取材2 只造模小鼠，观察其心肌组织H&E染色出现典型的病理变化，视为造模成功。期间记录小鼠的体重、活动状态和毛色变化等一般状态，并记录小鼠的死亡情况。造模成功的小鼠统一采取灌胃给药治疗。

造模成功小鼠随机均匀分为5 个实验组：模型组、环孢素组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组、姜黄素高剂量组，另以10只正常小鼠作为空白对照组。环孢素的临床推荐剂量为2～4 mg/kg，根据第4 版《中国药理实验方法学》，换算小鼠给药剂量为成人的9.01倍，确定本研究中小鼠每日环孢素的给药剂量为18.02 mg/kg；根据裴永彬等[9]研究姜黄素低、中、高剂量组的给药剂量，分别设为25 mg/kg、50 mg/kg 和100 mg/kg，给药体积均为200 μL/只。环孢素及姜黄素均溶于0.3%的羧甲基纤维素钠灌胃给药，空白对照组小鼠灌胃给予等体积的0.3%的羧甲基纤维素钠。每日1次，共给药14 d。

1.4 心肌组织H&E染色

给药结束后，颈椎脱臼处死各处理组小鼠，采用酒精消毒小鼠后，固定四肢，取材心脏组织；然后将其放入预先准备好的生理盐水中，漂去多余血液，滤纸吸干水分；然后再沿心脏左室长轴部位将其分成两份，一份采用4%多聚甲醛固定24h 后，进行常规石蜡包埋，制作组织切片和H&E染色。另一份采用液氮速冻存入-80 ℃冰箱用于组织蛋白检测。

1.5 生化指标相关检测

给药结束后，每组小鼠随机选取5只，摘眼球方式采集小鼠全血。静置后6 000 g 离心10 min 分离血清。根据ELISA 试剂盒说明书进行炎症相关因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 及心肌损伤相关分子CKMB和LDH的含量测定。

1.6 蛋白质免疫印记法检测心肌组织炎症及凋亡相关分子的表达情况

根据方法“1.4”项，每组小鼠随机选取5只取出低温保存的心脏。采用电动匀浆机打碎心脏组织。准备预冷的1×PBS，将待匀浆组织置于其中漂洗数次，洗去残余血液并用滤纸擦拭干净，称重计量。定量加入PBS，按组织重和1×PBS体积比为1∶9 的比例完成待测组织的匀浆准备。然后在4 ℃条件下，采用电动匀浆机进行心脏组织匀浆制备。以3 500 r/min 的转速离心10 min，转移上清液至新的EP 管中。采用BCA 法测定蛋白浓度，然后按照配胶、上样、电泳、电转和封闭的步骤分别进行SDSPAGE 电泳。通过目的蛋白Cleaved caspase-3、p-NF-κB和iNOS与内参蛋白GADPH灰度值的计算，观察心肌组织目的蛋白的表达情况。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件分析数据，GraphPad Prism5软件作图，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的一般状态观察

对实验小鼠的状态观察可见，空白对照组10只小鼠均正常饮食、皮毛光泽、活动正常、体重稳定升高，且无死亡出现；60只造模小鼠在首次注射CVB3病毒后第4天即出现饮食下降、皮毛粗糙无光泽，活动减少，体重也开始减轻，形态消瘦；第5 天出现死亡，至3 次病毒注射完成，造模小鼠共计死亡8 只，随机选取2只存活的模型小鼠进行组织学观察造模是否成功。剩余小鼠进行随机分组，模型组、环孢素组和姜黄素组分别10只，然后开始灌胃给药。给药期间，姜黄素组小鼠较模型组和环孢素组小鼠状态好，给药期间模型组小鼠死亡5 只，环孢素组3只，姜黄素低、中剂量组各1只，姜黄素高剂量组无死亡情况。

2.2 姜黄素对小鼠心肌组织病理学的影响

小鼠心肌组织H&E染色结果表明，空白对照组小鼠心肌细胞无明显损伤，形态完整，细胞核清晰可见，心肌排列整齐，纹理清晰，未见炎性细胞的浸润；与空白对照组比较，模型组小鼠则可见心肌组织的破坏，部分横纹肌发生断裂溶解，纹理错乱；给予姜黄素灌胃治疗后，可见心肌纤维排列相对整齐，心肌纹理恢复，心肌细胞的断裂溶解明显改善，其对心肌组织的保护作用较环孢素明显，见图1。

图1 各组小鼠心肌组织H&E染色结果（×200）

2.3 姜黄素对小鼠血清炎症相关因子的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高（均P＜0.001）；与模型组比较，姜黄素低、中、高剂量组均可显著降低小鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平（均P＜0.001），姜黄素高剂量组与环孢素组作用无明显差异（均P＞0.05），见表1。

表1 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较 ,n=5

表1 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较 ,n=5

与空白对照组比较，#P＜0.01，##P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.001；与环孢素组比较，&P＜0.001。

2.4 姜黄素对小鼠血清心肌损伤相关标记物表达的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠血清CK-MB和LDH 含量显著升高（均P＜0.001）；与模型组比较，姜黄素低、中、高剂量组小鼠血清CK-MB 和LDH 水平则明显降低（均P＜0.001），且姜黄素中、高剂量组下调CK-MB及高剂量组下调LDH的作用较模型组更明显（均P＜0.01），见表2。

表2 各处理组小鼠血清CK-MB和LDH水平比较 ,n=5

表2 各处理组小鼠血清CK-MB和LDH水平比较 ,n=5

与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.001；与环孢素组比较，&P＜0.01，&&P＜0.001。

2.5 姜黄素对模型小鼠心肌组织炎症及凋亡相关分子的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠心肌组织凋亡相关分子Cleaved caspase-3 及炎症相关分子p-NFκB 和iNOS 蛋白表达均显著上调（均P＜0.001）；与模型组比较，姜黄素低、中、高剂量组p-NF-κB、iNOS蛋白和姜黄素中、高剂量组Cleaved caspase-3蛋白表达均显著降低（均P＜0.05），姜黄素高剂量组下调p-NF-κB较环孢素组更加明显（P＜0.05），见图2和表3。

表3 各组大鼠心肌组织凋亡及炎症相关蛋白表达比较 ,n=5

表3 各组大鼠心肌组织凋亡及炎症相关蛋白表达比较 ,n=5

与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与环孢素组比较，&P＜0.05。

图2 各组小鼠心肌组织炎症及凋亡相关分子表达

3 结论

病毒性心肌炎是一种以病毒感染为病因的心脏局部或弥漫性病变，多见于青少年的CVB3 病毒感染。患者感染后会导致扩张性心肌病和心肌组织溶解坏死，但其致病的具体机制尚未阐明[10]。研究表明，病毒感染后，机体异常的免疫反应是引起该类疾病死亡的主要原因之一。除异常的免疫反应之外，心肌组织凋亡的触发在疾病的发生发展中也扮演着重要的角色[11]。Seko 等[12]研究发现，小鼠发生急性病毒感染后，心肌组织首先出现自然杀伤细胞的浸润，随后大量激活的T细胞产生，免疫细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α及TNF-β等也随之高表达，进而诱导心肌细胞损伤。姜黄素是一种具有广泛药理活性的天然药物活性成分。Ahmed等[13]证实姜黄素可改善大鼠实验性自身免疫性急性心肌炎，降低其硫氧还蛋白的免疫反应性。有报道姜黄素可调节肿瘤细胞的凋亡相关通路[14-15]。本研究结果发现，与空白对照组比较，模型小鼠在注射CVB3病毒后出现饮食下降、皮毛粗糙无光泽，活动减少，体重也开始减轻，形态消瘦及死亡等情况出现。给药后观察到姜黄素组小鼠较模型组和环孢素组小鼠状态好。小鼠心肌组织H&E染色结果表明，模型组小鼠相较于空白对照组小鼠可见心肌组织的破坏，部分横纹肌发生断裂溶解，纹理错乱。给予不同剂量姜黄素灌胃治疗后，心肌纤维排列相对整齐，心肌纹理恢复，心肌细胞的断裂溶解明显改善，且在一定范围内，高剂量姜黄素对心肌组织的保护作用更加明显。此外，血清炎症及心肌损伤相关标志分子检测结果显示，相较于空白对照组小鼠，模型组小鼠血清炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平和心肌损伤相关因子CK-MB和LDH含量均显著升高；给予CVB3 病毒感染模型小鼠不同剂量姜黄素治疗后，可见其血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 及CKMB和LDH含量水平均明显降低，姜黄素高剂量组与环孢素组作用无明显差异。由此可得，CVB3 病毒可致小鼠急性病毒性心肌炎的发生，影响小鼠心肌的组织结构和免疫稳态，给予姜黄素治疗后，可明显改善病毒所致小鼠心肌损伤。

病毒感染所导致的免疫失调及心肌细胞的凋亡是影响疾病进展的重要因素。caspase-3 属半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，是调节细胞凋亡的重要基因。且caspase-3为凋亡通路的关键分子[16]。NFκB 和iNOS 均参与介导免疫反应，NF-κB 是一种具有多功能调节作用的转录因子，参与多种细胞因子及炎性介质表达的转录调控，因此与炎性疾病有着密切的联系[17]。iNOS为一种诱导型一氧化氮合酶，其表达水平与炎性介质NO 含量呈正相关关系。NF-κB还被证实可调控iNOS的表达，进一步促进炎症发展[18-19]。雷蕾等[20]证实caspase-3分子及NF-κB/iNOS 通路参与了CVB3 诱导的病毒性心肌炎大鼠的心肌损伤过程。本免疫印迹结果检测显示，与空白对照组比较，模型组小鼠心肌组织凋亡相关分子Cleaved caspase-3及炎症相关分子p-NF-κB和iNOS蛋白表达均显著上调；给予姜黄素治疗后，可见蛋白Cleaved caspase-3、p-NF-κB 和iNOS 的表达水平较模型组明显降低，说明姜黄素也可作用于caspase-3、NF-κB和iNOS分子发挥下游效应。

综上所述，姜黄素可显著改善CVB3 病毒诱导的小鼠血清高TNF-α、IL-1β、IL-6、CK-MB 和LDH含量变化，且这一作用可能通过抑制caspase-3、NFκB和iNOS分子的蛋白表达实现。