基于网络药理学和动物实验探讨扶脉益心汤治疗冠脉微循环疾病的作用机制*

张耀杰，莫霄云，杨 朔，黄 琛，何贵新

（广西中医药大学附属瑞康医院，南宁 530011；广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023）

冠状动脉微循环是指由微动脉、毛细血管以及微小静脉组成的微循环系统，它的收缩与扩张可显著影响心肌血流量以及血管阻力[1]。经冠脉造影显示无冠脉狭窄，但症状反复、无明显减轻的患者考虑为冠脉微循环疾病（coronary microcirculation disease，CMD）[2]。心脏磁共振是目前认为有效检查冠脉微循环疾病的手段之一[3-4]。CMD 根据临床基础可分为无心肌疾病和阻塞性冠状动脉的CMD、心肌疾病的CMD 等多种类型[5]，可因结构性改变、内皮依赖血管舒张改变、非内皮依赖血管舒张改变等多种途径导致CMD[6-8]。CMD 类型多样、发病机制复杂，有效防治该疾病仍是国内、外研究的热门话题。目前西医治疗具有时效性，易反复发作。近年来关于中医药的研究报道越来越多，中医采用辨证论治，不良反应少，治疗CMD 有良好的临床疗效[9-10]。扶脉益心汤作为一中药复方，包括扶芳藤、三七、薏苡仁，具有抗炎、抗心肌缺血、抗氧化等作用，相对比以往已验证的“丹参、川芎”等单一活血化瘀药物，作用广泛、副作用更小。本文通过网络药理学方法预测潜在作用靶点及通路，用分子对接技术验证结合力，结合动物实验，探讨扶脉益心汤治疗CMD 的作用机制，为扶脉益心汤的临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 扶脉益心汤活性成分及药物靶点的筛选

在中药系统药理学分析平台（TCMSP）（http://tcmspw.com/tcmsp.php，2021-4-1）数据库以化合物口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18，对三七、薏苡仁的有效成分进行筛选，在Bataman（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，2021-4-1）数据库中设定score＞20，对扶芳藤的有效成分进行筛选，并结合文献。导入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/，2021-4-1）数据库，以“人类”为研究物种、取得分＞0 的候选靶标作为药物靶点。

1.2 CMD靶点的获取

使 用GeneCards（https://www.genecards.org/，2021-4-2）、OMIM(https://omim.org/，2021-4-2）、Disgenet（https://www.disgenet.org/，2021-4-2）等数据库以“Coronary Microvascular Dysfunction”为关键词进行检索，获得疾病作用靶点。

1.3 扶脉益心汤-CMD共同靶点的获取

在Venny2.1 在线软件作图工具平台上分别录入中药复方与CMD的靶点，绘制韦恩图，得到药物与疾病的共同靶点。

1.4 构建“扶脉益心汤－活性成分－作用靶点－CMD”网络

将上述得到的药物活性化合物和共同靶点导入Cytoscape3.7.1 软件，构建“药物－成分－靶点－疾病”相互作用网络图。

1.5 构建蛋白质相互作用（PPI）网络

将药物－疾病共同靶点输入到STRING((https://string-db.org/，2021-4-3)数据库中进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，minimum required interaction score＞0.4，所得信息输入Cytoscape3.7.1软件构建PPI 网络，将PPI 网络信息应用Cytohubba插件筛选核心靶点。

1.6 GO和KEGG分析

将药物—疾病共同靶点输入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/,2021-4-5)数据库得到GO、KEGG 所有词条相关信息，KEGG 分析利用微生信在线工具根据词条中富集基因数、P＜0.05 进行绘图，结果以气泡图形式输出。

1.7 分子对接

药物活性成分、共同靶点根据中心度（Degree）值取前5 位为核心成分及核心靶点，应用iGEMDOCK软件进行分子对接，软件采用“standard docking”对接，其余对接参数均为默认。

1.8 动物实验

1.8.1 构建动物模型 6～8 周龄无特定病原体动物（SPF）雄性大鼠共25 只，体重(180±20)g，来源于广西中医药大学动物实验中心，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK(京)2016-0006。取5只作为空白组，剩余的20只构建成CMD 模型，大鼠腹腔注射巴比妥进行全身麻醉（40 mg/kg），经口管辅助通气，打开胸腔暴露心脏及主动脉根部，采用一次性1 mL BD胰岛素针经左心室注入月桂酸钠(2 mg/kg 体质量),同时夹闭主动脉升部和主动脉弓连接处10 s以保证注入的月桂酸钠可以顺利进入冠状动脉，空白组注射生理盐水(2 mg/kg 体重)，关闭胸腔后回笼复苏，加热垫保持体温，手术过程注意无菌操作，术后常规给予青霉素80万单位腹腔注射预防感染，连续注射3 d，通过病理切片观察血管内微血栓形成判定造模成功。模型构建成功后随机分为模型组（CMD组）、尼可地尔组、扶脉益心汤低剂量组、扶脉益心汤高剂量组，每组5只。扶脉益心汤的中药组分（薏苡仁30 g、三七9 g、扶芳藤30 g）由广西中医药大学制药厂提供，用蒸馏水煎煮浓缩配置成1 g生药/mL的药液，冰箱保存。尼可地尔片5 mg/片（国药准字H14023308，公司：山西同达药业有限公司），使用时研磨成粉状，并用蒸馏水至所需浓度的混悬液。扶脉益心汤低、高剂量组(剂量分别为2 g·kg-1·d-1、8 g·kg-1·d-1)灌胃，尼可地尔组按2.4 mg·kg-1·d-1灌胃，空白组、模型组每日等剂量生理盐水灌胃。喂养4周。

1.8.2 实时荧光定量法 4 周后取各组大鼠60 mg心肌组织均匀研磨加入1 mL Trizol 提取总RNA，将RNA 逆转录为cDNA，进行PCR 扩增，反应体系：cDNA 模板1.0 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，SYBR Green Master 5μL，加ddH2O 至10 μL。反应条件：95 ℃，5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、35 s，共40 个循环。引物序列IL-6：上游5-TTCTTGGGACTGATGG-3’，下游5-TACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3’；IL-8：上游5-AGCCAACTCTCACTGAAGCC’-3’，下游5-AACTGTGAACAACAGGCCCA-3’；VEGFA：上游5-AATCAGTTCGAGGAAAGGGAAAGG-3’，下游5-AGGCTCACAGTGAACGCTCCAG-3’；MAPK3：上游5-CCAAACAAGCGCATCACAGT-3’，下游5-CCACTGGTTCATCTGTCGGA-3’。以Ct 值表示循环miRNA 表达水平，采用2-ΔΔCt法计算IL-6、IL-8、VEGFA、MAPK3 等基因相对表达量。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组均数比较采用t检验，偏态分布计量资料以中位数（四分位数）［M（P25～P75）］表示，多组间比较采用方差分析；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扶脉益心汤活性成分及药物靶点筛选

结合TCMSP、Batman 数据库及文献补充共得到有效活性成分25 个，见表1。通过Swiss Target Prediction数据库筛选出327个药物靶点。

表1 中药复方活性成分

2.2 CMD靶点筛选

在GeneCards、OMIM、Disgenet 数据库检索后，删除去重共获得疾病靶点1 604个。

2.3 扶脉益心汤-CMD共同靶点筛选

在Venny2.1在线软件作图工具平台上输入327个药物靶点、1 604 个疾病靶点，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点156个。

2.4 构建“扶脉益心汤－活性成分－作用靶点－CMD”网络

将中药复方中25 个有效活性成分与156 个药物－疾病共同靶点输入Cytoscape3.7.1软件中，绘制出“药物－成分－靶点－疾病”相互作用网络图（见图1）。图中紫色代表药物，蓝色代表中药复方中的25种活性成分，绿色代表156个共同靶点，红色代表疾病。

图1 中药复方－成分－靶点－疾病作用网络图

2.5 PPI网络分析

将156个共同靶点通过STRING数据库所得信息输入Cytoscape3.7.1 软件得到相互作用的PPI 网络图，然后应用Cytohubba 插件根据degree 值排名得到15个核心靶点（图2）。156个共同靶点颜色由黄色到红色，颜色越红degree值越高，越趋向于核心靶点，如图2a。经Cytohubba软件得到score 分值最高15个核心(hub)靶点如图2b。

图2 共同靶点及核心靶点PPI网络图

2.6 GO及KEGG分析

2.6.1 GO分析将156个共同靶点输入DAVID数据库得到GO 中生物学过程(BP)、细胞组分(CC)及分子功能(MF)3部分的相关词条信息，共富集至2 236条生物学过程、83条细胞组分表达过程、146个与分子功能过程中。3 个部分中BP 主要涉及signal transduction(信号传导)、positive regulation of cell proliferation(细胞增殖的正向调控)等；CC主要涉及plasma membrane(质膜)、nucleus(核心)等；MF 主要涉及protein binding(蛋白结合)、zincion binding(锌离子结合)等。

2.6.2 KEGG通路富集分析 将156个共同靶点通过DAVID 数据库进行KEGG 分析得到141 条富集通路，基于P＜0.05 的条件下，取富集基因数（count值）最高的前20 位用微生信在线软件绘制气泡图（见图3）。图中pvalue 代表富集的显著性，该值从小到大，对应红色到绿色，颜色越红则显著性越高。KEGG 分析结果显示以上靶点主要富集到PI3K-Akt 信号通路、FoxO 信号通路、VEGF 信号通路、HIF-1 信号通路等。结合CMD，关键通路主要涉及PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路。

图3 KEGG富集分析

2.7 分子对接结果

25 个药物活性成分、156 个共同靶点根据Degree值取前5位进行分子对接，5个核心成分分别是Quercetin（槲皮素）、Stigmasterol（豆甾醇）、Mandenol（十八碳）、DFV（二羟基黄烷酮）、2-Monoolein（2-单油酸甘油酯）,5 个核心靶点分别是AKT1（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1）、MAPK3（丝裂原活化蛋白激酶3）、EGFR(表皮生长因子受体)、SRC(原癌基因酪氨酸蛋白激酶)、VEGFA(血管内皮生长因子A)。将核心成分及核心靶点结构式图（见图4）导入iGEMDOCK软件得到AKT1、MAPK3、EGFR、SRC、VEGFA 与原有配体分子对接能量值分别是-130.18、-68.30、-78.27、-101.82、-83.71，5 个核心成分与这些核心靶点的对接能量负值接近或者高于核心靶点与原有配体分子的对接能量值，显示成分和靶点结合力较好。

图4 核心成分与核心靶点结构式图

2.8 荧光定量结果

荧光定量结果显示：模型组IL-6、IL-8、MAPK3等mRNA 表达水平高于空白组（P＜0.05），VEFGAmRNA 表达水平低于空白组。与模型组相比，扶脉益心汤高剂量组和尼可地尔组IL-6、IL-8、MAPK3 等mRNA 表达水平降低，VEGFAmRNA 表达水平升高（P＜0.05 或P＜0.01）；扶脉益心汤低剂量组IL-8、MAPK3 等mRNA 表达水平降低（P＜0.05），但在IL-6、VEGFA等mRNA表达上与模型组变化不显著（P＞0.05），见图5。

图5 IL-6、IL-8、VEGFA、MAPK3表达水平柱状图

3 讨论

2017 年我国专家学者发表共识，提出CMD 是冠脉微循环结构和(或)功能改变所致的劳力性心绞痛或心肌缺血客观证据的临床综合征[11]。CMD 影响着患者生活质量，加强该疾病的治疗具有重要的临床意义[12-13]。近年来西医治疗虽有效，但有时效性，容易反复。中医药治疗CMD，有良好的临床疗效，并且毒副反应少，适宜于长期用药。

扶脉益心汤作为中药复方，包含了薏苡仁、三七、扶芳藤等三味中药。薏苡仁可以降低人体血浆总胆固醇、降低血脂水平[14]，三七具有抗血栓、抗炎等作用[15]，扶芳藤具有抗血栓、调节血脂等作用[16]。

基于扶脉益心汤活性成分分析，通过分析得出25个有效活性成分，包括豆甾醇、薏苡仁酯、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、没食子酸、木栓酮等，其中豆甾醇、薏苡仁酯有调节血脂、降压等作用[17]。人参皂苷Rg1、三七皂苷R1 等具有抑制炎症因子、改善心肌氧代谢、抑制氧化应激等方面作用[18-19]。没食子酸、木栓酮具有降低心肌耗氧、清除氧化自由基等作用[20]。

基于PPI 分析及KEGG 分析，发现药物的活性成分与疾病的靶点密切关联。基于PPI网络结果得到AKT1、VEGFA、MAPK3、SRC、EGFR、STAT3、PTGS2、MMP9、MAPK8 等15 个核心靶点，这些核心靶点中心度值最高排名得到AKT1、MAPK3、EGFR、SRC、VEGFA 等关键核心靶点。AKT1 调节代谢、增殖、血管生成在内的许多过程；MAPK3 参与介导细胞生长、分化等生物过程；EGFR可以将细胞外信号转化为适当的细胞反应；SRC 参与基因转录、细胞凋亡、转化等生物过程；VEGFA诱导内皮细胞增殖，抑制凋亡和诱导血管通透性。这些关键核心基因功能与GO 分析BP 相对应。KEGG 分析结果结合CMD，关键涉及PI3K-Akt 信号通路、VEGF信号通路。PI3K-Akt信号通路，该通路的激活对细胞增殖、凋亡、氧化应激等方面有着重要作用，促进PI3K-Akt信号蛋白的表达可以减轻心肌缺血，对心肌缺血起着保护效应[21]。VEGF 信号通路，该通络的激活可诱发血管内皮生成内皮细胞，促进内皮细胞增值、转移，促进毛细血管网生成[22]。炎症在CMD 中起着重要作用，PI3K-Akt 信号通路、VEGF信号通路与炎症密切相关，激活这些通路可促进细胞释放IL-6、IL-8 等炎症因子，促进机体炎症反应[23-25]。关键核心靶点VEGFA、MAPK3均可富集到PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路中，动物实验验证通过荧光定量法检测IL-6、IL-8、VEGFA、MAPK3等mRNA表达水平，结合实验结果得出扶脉益心汤高剂量组对于模型组（CMD 组）可显著降低IL-6、IL-8等炎症因子水平，下调MAPK3靶点基因，上调VEGFA 靶点基因（P＜0.05），说明扶脉益心汤通过作用于抗炎、抗氧化、改善细胞内皮功能等相关的靶点及通路，从而达到治疗CMD 的目的。分子对接结果显示成分与靶点间具有较强的结合力，进一步支持了网络药理学和动物实验结果。

综上所述，扶脉益心汤可以通过多成分、多靶点、多通路途径作用于CMD，但本研究亦存在一定局限性，缺乏大样本、多中心的临床研究支持，有待进一步验证。