肺力咳合剂对支气管哮喘大鼠气道炎症反应的影响及其机制研究*

谢叶红，蒋顺宁，胡雪竹，李学冬

（四川省成都市郫都区中医医院，成都 611730）

随着工业化程度的迅速发展，全球支气管哮喘患病率逐年增高[1]。目前针对哮喘患者，临床常选用激素类药物，但该类药物的抗炎作用对重度或激素抵抗型哮喘类患者治疗效果并不理想[2]。慢性炎症反应引起机体气道高反应性，反复发作导致病情严重、治疗困难，而激素抵抗患者可能是激素与胞浆内激素受体特异性结合效率降低，受体表达量不足，从而难以发挥药物抗炎作用[3]。肺力咳合剂由黄芩、前胡、百部等中药配合制成，具有清热解毒、止咳祛痰功效，常用于治疗小儿支气管炎、肺炎等[4]。目前关于肺力咳合剂对哮喘进展中气道炎症反应的抑制作用及其机制研究尚少。有研究证实，核转录因子-κB（NF-κB）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在调控哮喘炎症反应和免疫反应中起关键性作用[5]。鉴于此，本研究观察肺力咳合剂对哮喘大鼠气道炎症的抑制作用，并探讨其对炎症反应信号通路NF-κB/MAPK的影响，以期为临床用药提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠，50只，4周龄，体重（200±20）g，购自南京大学模式动物研究所，动物生产许可证号：SCXK（苏）2016-0001，动物使用许可证号SYXK（皖）2017-005，实验动物伦理审批号：IACUC-20170701，实验符合减少、替代和优化（3R）原则。

1.2 药物和主要仪器、试剂

肺力咳合剂（贵州健兴药业有限公司，国药准字Z20025136，规格：100 mL，批号：20170628），卵清蛋白（Sigma-A5503，批号：326A056），氢氧化铝粉（Thermo 公司，批号：OA181048），白介素（IL）-6（批号：2017110201A）、IL-1β（批号：2017110122A）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo 公司，批号：23225、34617），反转录试剂盒（Takara 公司，批号：6210A），DAB 显色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：DA1010），兔抗鼠NF-κB p65、p-p65单抗、p38 MAPK、p-p38 MAPK 多抗（Santa Cruz 公司，批号：1783-1、1758-1、1752-1、1830-1）；JZ-8B 型大小鼠雾化给药器（北京九州晟欣科技有限公司），SM2010R切片机、EG1150分体式包埋机（徕卡显微系统贸易公司），CX23 光学显微镜（奥林巴斯公司），800TS酶标仪（Bio-Tek公司），TY-80电泳仪（南京普阳科学仪器研究所），iQ5 实时荧光定量PCR（qPCR）仪、CheniDoc XRS 化学发光成像分析系统（Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的构建及实验分组 取50只大鼠，其中40 只腹腔注射卵清蛋白致敏和雾化吸入法建立哮喘大鼠模型[6]：实验第1、第8 天分别腹腔注射2 mL 致敏混悬液（卵清蛋白1 mg+氢氧化铝粉100 mg），第15天起，给予50 mL 1%卵清蛋白（溶于生理盐水）进行雾化40 min，2 d/次，共6 次，大鼠出现呼吸加快、精神萎靡、黏膜发绀等情况时提示建模成功，将其随机分为4组：哮喘组、实验1组、实验2 组、实验3 组。剩余10 只均以生理盐水代替致敏混悬液和雾化液，其他操作相同，设为对照组。末次雾化后6 h，实验1 组、实验2 组、实验3 组大鼠分别给予1 mL/kg、2 mL/kg、4 mL/kg 肺力咳合剂灌胃，哮喘组和对照组均给予等量生理盐水灌胃，连续7 d。

1.2.2 肺泡灌洗液（BALF）中IL-6、IL-1β、TNF-α水平检测 收集BALF 离心上清液，应用ELISA 检测BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量，所有操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行，酶标仪检测570 nm波长处吸光度值，根据建立的标准曲线计算IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.3 肺组织病理观察 取大鼠右肺组织，立即放入4%中性甲醛中浸泡24 h，常规石蜡包埋，制作4 μm连续切片，经二甲苯脱蜡、酒精梯度水化、热修复后，行苏木精－伊红（HE）染色，以中性树胶封片后于光镜下观察。

1.2.4 qPCR 法检测肺组织NF-κB p65、p38 MAPK mRNA 相对表达量 取新鲜右肺组织约75 mg，采用Trizol 法提取组织中总RNA，逆转录为cDNA 后进行PCR 扩增。PCR 反应体系：cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，10×buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq 8.5 μL，ddH2O 10 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重复42 个循环。以β-actin 为内参，采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量，所有实验重复3次，取平均值。NF-κB p65 上游引物：5’-ATCTGCTAGTCGATCGATCGTAG-3’，下游：5’-CATCGATCGTAGCATCGATCGTA-3’；p38 MAPK上游引物：5’-ATCAGATGCTAGCTAGCTAGCGC-3’，下游：5’-CTAGCTACGATCGATCGATCGTAT-3’；β-actin 上 游 引物：5’-AAGCTACGATCGATCGTACGTGG-3’，下游：5’-GGTCAGTCGTACGTAGCTACGTC-3’。

1.2.5 Western blotting 法检测肺组织NF-κB p-p65和p-p38 MAPK 蛋白表达 取新鲜右肺组织约75 mg，匀浆仪研磨后转至离心管，加入细胞核裂解液，12 000 r/min离心10 min后取上清液，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE 分离蛋白，60 min 后将蛋白转至硝酸纤维素膜上；封闭2 h，加入一抗稀释液（均为1∶800）置于4 ℃冰箱摇床孵育过夜，然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶10 000），室温下孵育1 h。ECL暗室发光显色，凝胶成像系统扫描，ImageJ 软件分析蛋白条带灰度值。计算NFκB p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK 蛋白比值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件分析数据。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较

5 组BALF 中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平从低至高排列如下：对照组、实验2组、实验3组、实验1组、哮喘组，组间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较pg/mL，

表1 BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较pg/mL，

与对照组比较，aP＜0.05；与哮喘组比较，bP＜0.05；与实验1组比较，cP＜0.05；与实验2组比较，dP＜0.05。

2.2 肺组织病理学观察

HE 染色显示：对照组无明显异常，哮喘组肺泡轮廓不清晰、肺泡壁水肿、增厚明显，多量炎性细胞浸润；实验组上述变化均较哮喘组减轻，其中实验2组减轻最为明显，见图1。

图1 大鼠肺组织HE染色图（×400）

2.3 5组肺组织中NF-κB p65、p38 MAPK mRNA相对表达量比较

5组大鼠肺组织中NF-κB p65、p38 MAPK mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 5组肺组织NF-κB p65、p38 MAPK mRNA相对表达量比较

表2 5组肺组织NF-κB p65、p38 MAPK mRNA相对表达量比较

2.4 5 组肺组织NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白比值比较

5组肺组织NF-κB p-p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK 蛋白比值从低至高排列如下：对照组、实验2组、实验3组、实验1组、哮喘组，组间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2、表3。

图2 Western blotting蛋白电泳图

表3 5组肺组织NF-κB p-p65和p-p38 MAPK蛋白表达量比较

表3 5组肺组织NF-κB p-p65和p-p38 MAPK蛋白表达量比较

与对照组比较，aP＜0.05；与哮喘组比较，bP＜0.05；与实验1组比较，cP＜0.05；与实验2组比较，dP＜0.05。

3 讨论

肺力咳合剂方以黄芩、前胡、百部为君药，归肺经，具有宣肺止咳、清热利湿、降气化痰功效；红花龙胆、梧桐根为臣药，归肺、肝、胆、大肠经，具有清热解毒、合血祛湿功效；白花蛇舌草、红管药为佐使药，归胃、大肠、小肠经，可增强前胡清热利湿作用，且可加强升降协助[7-9]。诸药合用，共奏宣散肺邪、化痰平喘之功效。现代药理学研究发现，肺力咳合剂组方中的红花龙胆具有较强的抗乙酰胆碱受体抗体作用，可缓解支气管平滑肌痉挛，同时具有抑制炎症渗出作用[10]。黄芩作为肺力咳合剂的主要成分之一，在抑制气道炎症反应中发挥中药作用，Wang 等[11]通过应用不同剂量黄芩苷对慢性阻塞性肺病大鼠模型进行干预，发现黄芩苷具有保护肺功能、调节肺部促炎和抗炎因子、抑制气道阻塞和抗氧化的作用。

NF-κB/MAPK 信号通路异常激活通过酶促级联反应调控关键靶分子转录进程，从而控制目的基因表达[12-13]。NF-κB正常情况下并无活性，当环境变化或者受到异常刺激后，上游通路接收相应信号转导后NF-κB磷酸化激活转至核内，通过调控下游促炎因子和炎症抑制因子基因的转录和表达，加重炎症反应，而哮喘患者气道重构及炎症反应的发生与发展均与NF-κB磷酸化相关[14]。本研究采用注射卵清蛋白致敏引发哮喘后，大鼠气道损伤严重，可能与MAPK 信号通路激活，引发炎症级联反应有关，与既往动物实验研究结果相似[15]。肺力咳合剂中含有黄芩，吴佳等[16]研究发现，黄芪多糖可通过抑制Toll-样受体4（TLR4）/NF-κB 信号通路而抑制慢性阻塞性肺疾病患者炎症反应；在蒋寅等[17]的研究中，黄芪苷可通过抑制NF-κB/MAPK 信号通路而抑制炎症损伤，推测肺力咳合剂可能通过直接或间接激活NF-κB/MAPK信号通路发挥抗炎作用。此外，肺力咳合剂中红花龙胆、梧桐根也具有显著抑制炎症反应，可能通过抑制NF-κB、MAPK磷酸化而达到抑制炎症细胞趋化及炎症因子分泌的作用。

气道平滑肌细胞大量增生甚至变形可导致正常气道结构改变，同时伴随细胞外胶原沉积、基底膜增厚、腺体及周围小血管及毛细血管增生等变化均是哮喘患者气道重塑的病理基础，而单纯抗炎治疗可能仍难以控制甚至抑制气道重塑进程[18]。本研究应用不同剂量肺力咳合剂对对哮喘大鼠进行干预后发现，哮喘组肺组织炎症反应明显；3个实验组炎症反应均减轻，其中实验2组减轻最为明显，提示肺力咳合剂可有效缓解哮喘大鼠气道炎症，以2 mL/kg剂量效果最佳。哮喘大鼠肺组织炎症病变减轻证实，肺力咳合剂对哮喘大鼠气道炎症有显著抑制作用。各组肺组织NF-κB p-p65/NF-κB p65、pp38 MAPK/p38 MAPK 蛋白比值比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示肺力咳合剂对哮喘大鼠气道炎症的减轻作用与抑制NF-κB/MAPK 信号通路有关。由此可见，肺力咳合剂对哮喘大鼠气道炎症的缓解作用机制可能与抑制NF-κB/MAPK 信号通路有关。

本研究也存在一定不足之处，关于肺力咳合剂是否通过其他信号通路抑制气道炎症反应未进行探讨，在进一步的研究中，需增加其他信号通路变化的研究，为肺力咳合剂用于抑制哮喘患者炎症反应提供更多理论支持。