miR-302c靶向CREB1基因通过P53信号通路影响肺癌的侵袭和迁移

张冉 石长林 苟小军 何鸿晏

作者单位：四川省巴中市中心医院胸心外科（四川省巴中市636000）

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈现逐年上升趋势[1]。肺癌是由肺部上皮细胞的异常增殖导致，但其具体机制尚未阐明，尽管手术、放化疗等治疗手段有了较为明显的突破，但晚期肺癌患者的5年生存率仍未明显改善。有研究[2]显示，导致肺癌患者治疗失败的主要原因是淋巴、胃等器官的恶性转移。因此，深入揭示肺癌的发病、发展以及转移的分子机制，寻找肿瘤转移的分子靶点，有助于临床上开展个体化的靶向治疗，提高晚期肺癌患者的生存[3]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是包含19～22个核苷酸的单链非编码的生物小分子。有研究显示，miRNA 在癌细胞的恶性增殖与转移过程发挥促癌或抑癌作用[4]。miR-302c 属于miR-302 家族中的一员，在肝癌、胶质瘤、胃癌等恶性肿瘤中发挥抑癌作用。Ye 等[5]研究报道miR-302c 在肺癌中表达异常，与患者的不良预后关系密切。但并未详细探讨miR-302c在肺癌中的作用机制。转录因子环磷酸腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白-1（cAMP-responsive elementbinding protein-1，CREB-1）是细胞内重要的转录调控基因[6]。Jiang 等[7]研究表明，作为机体内重要的原癌基因，CREB-1 在白血病、肾癌、乳腺癌等肿瘤组织中的表达高于正常组织，且在肿瘤细胞的恶性转移中发挥重要作用。但是有关CREB-1 在肺癌中的报道较少。本研究通过对在线数据库以及肺癌细胞株A549的研究，探讨miR-302c 和CREB-1 在肺癌中的作用机制，以期为临床上肺癌的个体化治疗提供潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 永生化人肺支气管上皮细胞BEAS-2B、人肺癌A549 细胞、人胚胎肾细胞293T 均购自美国ATCC，miR-302c-mimic 和miR-302c-mimic-NC 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.1.2 试剂与仪器 鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体购自美国Jackson 公司；CCK-8试剂盒、Western blot 试剂盒均购自美国Invitrogen公司；Transwell 小室购自美国Sigma-Aldrich 公司；苏净Airtech 超净工作台购自美国Thermo Fisher 公司；BD-56 集成式恒温恒湿细胞培养箱购自德国BINDER 公司；IXplore Standard 倒置显微镜购自日本Olympus 公司；Multiskan Sky 全波长酶标仪购自美国Thermo Fisher 公司；Hitachi H-600 透射电子显微镜购自日本日立公司。

1.1.3 在线生物数据库信息 收集在线生物基因数据库GEO 中GSE19945 和GSE136043 两组肺癌数据集信息。GSE19945 为手术切除的肺癌组织样本的miRNA 芯片数据，包括8 例正常肺组织、4 例肺腺癌、11例大细胞神经内分泌癌、35 例小细胞肺癌、5例鳞状细胞癌。GSE136043 为15 例肺腺癌组织、25例淋巴结转移组织以及5 例正常组织的miRNA 芯片数据。Kmplot 网站（https://kmplot.com/analysis/）用于评估数据库中的肺癌样本中的生存率，通过UALCAN数据库分析TCGA 数据库中获得差异表达的基因，获取靶标信息[8]。

通过Human Protein Atlas 数据库（https://www.proteinatlas.org/）分析CREB1 在正常人体不同组织中的分布情况，以及CREB1 在正常肺组织以及肺癌中的表达情况[9]。

1.2 方法

1.2.1 定量反转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）检测BEAS-2B 细胞和A549 细胞中miR-302c 和CREB1的mRNA 的表达 使用Trizol 试剂盒分别提取细胞总RNA，根据Prime Scrip TM 试剂要求逆转录生成反义cDNA，以此为模板采用PCR 仪进行扩增[10]（95℃，5 s，单次循环后；95℃，5 s；60℃，60 s，采集荧光信号40 个循环）；各目的基因mRNA 的相对表达量采用2–△△CT表示。使用序列如下：

内参U6 上游引物为 5’-GCCAAGGCTGTGGGC AAGGT-3’，下游引物为 5’-TCTCCAGGCGGCACG TCAGA-3’；miR-302c 上游引物为 5’-AGCCTTGCAG AAAAGAGAGC-3’，下游引物为5’-AGCTAGTTGTC ATCCTGCT-3’；CREB1 mRNA 上游引物为 5’-AGC TAGTTGTCATCCTGCT-3’，下游引物为5’-AGGAAG TCTTTCAGTGATGT-3’。

1.2.2 双荧光素酶实验 使用生物信息学数据库miRactDB（https://ccsm.uth.edu/miRactDB）判断miR-302c 和CREB1 存在特异性结合位点。推测CREB1可能为miR-302c 的靶基因。293T 细胞常规培养，依次构建突变型pGL3-CREB1-3-UTR-MUT 和野生型pGL3-CREB1-3-UTR-WT 质粒，将100 ng 质粒通过Lipofectamine2000分别共转染至293T 细胞，按试剂盒要求培养细胞，48 h 后以PROMEGA 双荧光素酶系统检测萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶的活性比值[11]。

1.2.3 细胞培养以及分组处理[12]将人A5491 接种于含有灭活的10%胎牛血清的DMEM 培养基中，37℃，5%CO2培养。将细胞分为正常组、对照组和实验组，正常组不加任何药物，常规培养；对照组将细胞转染150 nmol/L 的miR-302c-mimic-NC 后常规培养；实验组将细胞转染150 nmol/L 的miR-302c-mimic 后常规培养。

1.2.4 观察细胞超微结构改变 调整细胞的浓度至1×106个/mL 接种于6 孔板上，分组处理同上，将细胞在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养48 h 后，固定，包埋，制成超薄切片，醋酸双氧铀-枸橼酸铅双重染色[13]，Hitachi H-600 透射电子显微镜下观察各组细胞的超微结构改变。

1.2.5 Transwell 实验 在Transwell 小室平板平铺一层Matrigel 基质胶（约50 μL）并将以无血清培养基中的各组单细胞悬液加至上室（侵袭实验中铺Matrigel 胶，迁移实验中不铺胶），在小室下室平铺含有灭活的10%胎牛血清的DMEM 培养基，置入37℃，5%CO2培养箱常规培养24 h，清洗后，甲醛固定；染色后，显微镜下观察并对穿过膜的细胞进行计数[14]。

1.2.6 小管形成实验 在96 孔培养板上平铺一层新鲜Matrigel 溶胶，迅速转移进无菌培养箱（37℃），待Matrigel 溶胶凝固后，将HUMCEs 细胞以1×104个/mL接种在96 孔板中，分组同上，分别加入含A549 细胞的培养上清液，继续培养48 h，倒置光学显微镜下观察HUMCEs 的血管生成情况并拍照记录[15]。

1.2.7 Western blot 检测 胰酶消化细胞，离心稀释成细胞悬液，分组处理同上，按1×105个/孔接种至6孔板中培养24 h，加入蛋白裂解液，常规提取总蛋白，测定浓度，置于沸水中变性，进行电泳分离，转模，清洗后，在封闭液中孵育30 min，加入一抗（1∶500），孵育过夜，加入二抗（1∶1 000），二氨基联苯胺（DAB）显色[16]，以GAPDH 作为内参，Image J 图像分析软件统计分析各条带的灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。采用Graphpad5.01 绘制统计图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-302c 和CREB1 在肺癌组织中的表达

针对数据集GSE19945 中的标本进行分析，结果显示miR-302c 在肺癌中的表达最低（图1）；针对数据集GSE136043 的标本进行分析，结果显示miR-302c在出现淋巴结转移的患者中的表达水平降低（图2）。两数据集经Kmplot 分析显示，miR-302c 高表达的肺癌患者的生存期为（77.52±8.45）个月，明显高于miR-302c 低表达的肺癌患者（45.92±6.43）个月（图3），提示miR-302c 在肺癌中的表达与患者的预后以及恶性转移关系密切。

图1 在GSE19945 样本中表达差异明显的miRNA 的热图

图2 miR-302c 在GSE136043 样本中表达差异明显的miRNA 的热图

图3 miR-302c 不同表达水平患者的生存期

Human Protein Atlas 数据库显示，CREB1 在脑、鼻咽、胃、肝、肾、支气管、肺等组织和器官中广泛存在，数据内的组织样本经免疫组织化学法检测后，与正常组织相比，肺癌组织中CREB1 的表达明显升高（图4）。

图4 CREB1 在人体中以及肺脏和肺癌组织中的表达

2.2 qRT-PCR 检测BEAS-2B 细胞及A549 细胞中miR-302c 和CREB1 mRNA 的表达

qRT-PCR 结果显示，与正常BEAS-2B 细胞相比，A549 细胞中miR-302c 的表达明显下降，CREB1 的mRNA 表达明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05，图5）。

图5 细胞系中miR-302c 和CREB1 的mRNA 表达

2.3 双荧光素酶实验

上述研究结果提示，在肺癌中miR-302c 和CREB1 基因的表达具有一定的相关性；在线生物信息数据库miRactDB 显示miR-302c 和CREB1 基因存在特异性结合位点。双荧光素酶报告基因结果显示，转染miR-302c 后，野生型CREB1 的荧光素酶活性被抑制（P<0.05），突变型CREB1 荧光素酶活性无明显变化（P>0.05），提示miR-302c 与CREB1 具有靶向调控关系（表1，图6）。

图6 双荧光素酶实验

表1 miR-302c 和CREB1 基因的结合位点

2.4 电镜观察细胞的超微结构变化

电镜观察结果显示，正常组细胞结构完整，清晰可辨，细胞质内内容物数量丰富，线粒体、内质网、核糖体以及高尔基体等细胞器结构完整，线粒体嵴结构清晰可辨，核质界限清晰；对照组细胞的细胞质界限清晰，线粒体嵴结构正常，核仁性状稳定；实验组细胞的细胞质界限不清，胞膜缺失严重，线粒体呈现空泡样变性，嵴结构数量明显减少，染色质固缩、聚集明显，核膜凹陷缺失明显，细胞超微结构损伤严重（图7）。

图7 各组细胞超微结构的改变（×8 000）

2.5 Transwell 小室检测细胞的侵袭与迁移能力

Transwell 小室结果显示，与正常组相比，实验组迁移和侵袭的细胞数量明显下降，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；正常组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05，图8，9）。

图8 Transwell 小室迁移实验

2.6 小管形成实验检测血管生成能力

小管形成实验结果显示，与正常组相比，实验组细胞小管生成的数量明显下降（P<0.05）；正常组与对照组相比，差异无统计意义（P>0.05，图10）。

图10 小管形成实验

2.7 Western blot 检测细胞中CREB1、p-P53、p-P21的表达水平

从蛋白质数据库中研究发现，CREB1 和P53 存在调控位点（图11），为进一步探索CREB1 基因的作用通路，采用Western blot 检测各组细胞中P53、P21的磷酸化水平。结果显示，与正常组相比，实验组细胞中CREB1 的表达明显下降，p-P53、p-P21 的表达明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；正常组与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05，图12）。

图9 Transwell 小室侵袭实验

图11 CREB1 和P53 存在调控位点

图12 各组细胞中CREB1、p-P53、p-P21 的表达

3 讨论

作为一种常见的呼吸系统疾病，肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤前列。目前，临床上主要以放疗、化疗、手术以及免疫治疗为主，但在提高晚期肺癌患者的5年生存率方面，现有的治疗手段均面临严峻的挑战[17]。大量的临床数据显示[18]，肺癌患者死亡的主要原因是肿瘤细胞的靶器官侵袭以及恶性转移。因此，研究肺癌细胞的侵袭与转移的分子机制，寻找有效可靠的治疗靶点，为患者寻找安全的分子靶向治疗方案，成为该领域的研究热点。

研究显示[19]，作为体内重要的非编码基因，miRNAs 参与调控肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、血管新生、化疗耐药以及侵袭与转移等生物学过程。Guo等[20]研究证实miR-151a-5p、miR-23b 等多种miRNA在肺癌中表达异常，并影响肿瘤细胞的增殖与侵袭等。作为miR-302 家族中的一员，miR-302c 在肝癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中发挥抑癌作用，并引起广泛关注[21]。Ma 等[22]研究表明miR-302c 靶向调控转录因子激活蛋白-4（AP-4）基因的表达，抑制大肠癌细胞的上皮间质转化以及癌细胞转移。Wang 等[23]研究证实miR-302c 抑制细胞周期蛋白cyclin O（CCNO）基因的表达从而诱导宫颈鳞状细胞癌的凋亡。本研究中通过对在线生物信息数据集GSE1994 和GSE 136043 研究发现，miR-302c 在肺癌中存在低表达的现象，并且miR-302c 在肺癌中的表达与患者的预后以及恶性转移关系密切；细胞实验显示，过表达miR-302c 后，A549 细胞超微结构损伤严重，细胞的侵袭与转移能力以及血管新生能力明显下降。

有研究[24]显示，肿瘤细胞的侵袭与转移是肺癌发展中的重要的环节，肿瘤血管新生是癌细胞进行侵袭和转移的主要途径。Ramadan 等[25]研究指出，众多信号通路与靶基因参与或调控肿瘤细胞的侵袭与转移过程。CREB1 是细胞内功能明确的促癌基因。Hu 等[26]研究显示，在乳腺癌中抑制CREB1 的表达能明显抑制乳腺癌细胞的体内生长与靶器官转移。Cheng 等[27]研究显示CREB1 高表达的结肠癌患者的预后不佳，并且发生多处靶器官的转移。本研究通过对Human Protein Atlas 数据库的数据进行研究显示，CREB1 在肺癌中处于高表达的状态。qRT-PCR 结果显示，与正常肺组织细胞相比，在A549 细胞中miR-302c 的表达明显下降，CREB1 的mRNA 表达明显升高，验证了数据库的研究结果。双荧光素酶结果显示miR-302c 能靶向调控CREB1 的表达。

揭示靶基因的作用位点，能更深入地阐明肿瘤转移与侵袭的分子机制。P53 信号是细胞内重要的抑癌通路，Lacroix 等[28]研究显示该通路中的P53、P21 经磷酸化后具有生物活性，并广泛影响肿瘤细胞的代谢、增殖、细胞周期以及转移与侵袭等生理病理过程。Vennin 等[29]研究指出P53 信号通过调控下游相关基因的转录，推动P21 等相关抑癌分子的磷酸化，抑制胰腺癌细胞的上皮间质转化过程。Wang 等[30]研究显示，在前列腺癌中，CREB1 能调控P53 的活性，抑制肿瘤细胞的血管生成。本研究结果显示，P53 与靶基因CREB1 存在特异性结合位点。Western blot 结果显示实验组细胞CREB1 的表达明显下降，p-P53、p-P21 的表达明显升高。

综合上述，miR-302c 在肺癌组织表达降低，过表达miR-302c 后能明显抑制肺癌细胞的侵袭与转移，这可能与抑制靶基因CREB1 的表达以及P53 信号激活有关。但miR-302c 在肺癌临床治疗的价值尚需更深入的研究。