长链非编码RNA-EPIC1在前列腺癌中的表达及其临床意义

2021-08-19唐智国

安徽医学 2021年7期

唐智国魏灿邰胜

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是严重威胁老年男性健康的恶性肿瘤，在欧美发达国家是男性发病率第一的恶性肿瘤。近年来，随着我国民众饮食结构的变化，PCa的发病率也迅速升高，已成为我国最常见的恶性肿瘤之一。长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一类无蛋白质转录功能的RNA，广泛存在于人体组织中，参与调控细胞生长分化、恶性转变等多种生理病理过程，作用机制复杂。现已证实LncRNA在PCa的发生和发展中起到重要作用。表观遗传诱导LncRNA-1(Epigenetically-induced lncRNA1,EPIC1)是新近发现的一种LncRNA，在肺癌、胆管癌的进展中起到重要作用。本文研究了EPIC1在PCa细胞系和病理组织中的表达情况，探讨了EPIC1与PCa预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2017年3月至2020年1月在合肥市第八人民医院、合肥市第二人民医院及安徽医科大学第一附属医院诊断为PCa并手术切除的10例病理标本，取新鲜肿瘤组织及癌旁正常组织(距肿瘤边缘>3 cm并经病理检查确认无癌细胞浸润)。另收集2012年1月至2020年1月上述3家医院病理科贮存的有详细随访信息的69例PCa手术标本进行数据分析，患者平均年龄(69.70±6.64)岁，均行PCa根治术并辅以术后内分泌治疗。以上组织均在手术切除后，迅速浸于RNA保存液并超低温冷冻保存。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者或家属均知情并签字同意。

1.2 细胞培养和转染人PCa细胞系(PC3、DU145)和人前列腺正常细胞系(RWPE-1)购自美国模式培养物集存库，细胞复苏后，培养于37℃、5%CO培养箱中，选取对数生长期细胞进行研究。将PCa细胞接种于6孔板后，随机分为siR-EPIC1组与siR-NC组，每组18株。用Lipo2000脂质体转染法转入siRNA。siR-EPIC1组引物序列：上游5’-CCUUCAGACUGUCUUUGAA-3’，下游5’-AGUGUGGCCUCAGCUGAAA-3’；siR-NC组引物序列：上游5’-AGACCUUCAUCAAAAACAU-3’，下游5’-GAGCUAAAACGGAGCUUUU-3’。

1.3 实时定量聚合酶链反应(Real-Time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)分析取40 mg组织标本，Trizol法提取总RNA，再用Omniscript RT试剂盒将RNA反转录成cDNA。采用SYBR Select Master Mix试剂盒、ABI PRISM 7000进行RT-PCR反应检测EPIC1的表达，反应条件：95℃预热5 min,95℃变性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸15 s,40个循环。采用2法计算EPIC1表达量。EPIC1引物序列：上游5’-TATCCCTCAGAGCTCCTGCT-3’，下游5’-AGGCTGGCAAGTGTGAATCT-3’；内参U6引物序列：上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 细胞增殖实验(CCK-8法) 将细胞接种于96孔，接种密度5×10个/孔，分别培养1、2、3、4和5 天后，弃去培养液，每孔加入100 μL的CCK-8检测液，作用30 min后，在酶标仪上检测450 nm处的吸光度值。

1.5 细胞侵袭实验(Transwell法) 将预先配置好的Matrigel基质胶铺在Transwell小室的上室底膜，将200 μL无血清细胞培养液接种于上室，接种密度每毫升2.5×10个，下室置入700 μL含血清的完全培养基，培养24 h后弃上室培养基，棉签拭去上室里的细胞，多聚甲醛固定细胞后，用结晶紫染色，倒置显微镜下，计数从上室侵袭至下室的细胞数。

1.6 随访最后随访日期为2020年8月，全部患者中位随访31.3个月(8～67个月)。随访的内容主要包括患者身体的一般状况、生存状态等。

2 结果

2.1 EPIC1在PCa细胞系和PCa组织中的表达情况 EPIC1在PC3、DU145中的表达量分别为(0.12±0.02)和(0.20±0.03)，在RWPE-1中的表达量为(0.01±0.001)。与RWPE-1细胞相比，EPIC1在PC3、DU145细胞中的表达增高，差异有统计学意义(

RWPE-1 PC3=10.515,

=0.001；

RWPE-1 DU145=17.144,

<0.001)。EPIC1在患者PCa组织中的平均表达量为(0.61±0.05)，在癌旁正常组织中的平均表达量为(0.06±0.003)，差异有统计学意义(

=23.687，

<0.001)。2.2 EPIC1对PCa细胞增殖能力的影响在PC3细胞中转入siRNA后的第1、2、3、4和5天，siR-EPIC1组和siR-NC组的吸光度均有升高的趋势,不同组别和处理时间对PC3细胞增殖能力无交互作用(

>0.05)。siR-EPIC1组在各个时间点的吸光度均低于siR-NC组，细胞增殖能力下降，组间差异有统计学意义(

<0.05)。见表1。

表1 PC3细胞siR-EPIC1组与siR-NC组各时间点吸光度比较

在DU145细胞中分别转入siR-EPIC1和siR-NC后，不同组别和处理时间对DU145细胞增殖能力无交互作用(

>0.05)。相较于siR-NC组，siR-EPIC1组细胞的增殖能力下降，组间差异有统计学意义(

<0.05)。见表2。

表2 DU145细胞siR-EPIC1组与siR-NC组各时间点吸光度比较

2.3 EPIC1对PCa细胞侵袭能力的影响在PC3细胞中，siR-NC组侵袭的细胞数为(259.25±43.59)，siR-EPIC1组为(73.25±25.75)，两组差异有统计学意义(

=7.348,

<0.001)。在DU145细胞中，siR-NC组侵袭的细胞数为(182.75±35.52)，siR-EPIC1组为(53.25±17.13)，两组差异有统计学意义(

=6.568,

<0.001)。Tranwell检测显示，siR-EPIC1抑制了PC3和DU145细胞的侵袭能力。见图1。

图1 siR-EPIC1对PCa细胞的侵袭能力的影响

2.4 EPIC1的表达水平与PCa患者临床病理参数之间的关系采用RT-PCR法分别检测EPIC1在69例PCa组织中的表达量，再以表达量的平均值为界，将患者分为EPIC1高表达组(

=38)和低表达组(

=31)。相较于EPIC1低表达组，EPIC1高表达组的Gleason评分高，局部淋巴结转移明显，TNM分期晚，差异有统计学意义(

<0.05)。见表3。

表3 EPIC1高表达组与低表达组患者临床病理参数比较[例(%)]

2.5 EPIC1的表达水平与患者生存率的关系 69例患者总体的3年生存率为62.5%，其中EPIC1高表达组患者的3年生存率为53.7%，低表达组为78.1%。Kaplan-Meier法生存分析结果显示，EPIC1高表达组患者生存曲线在各个时间段均低于低表达组，两组患者生存率的差异有统计学意义(

=0.040)。见图2。

图2 EPIC1高表达组与低表达组患者生存分析

3 讨论

生物信息学研究表明，LncRNA在多种人类肿瘤细胞中起到抑癌或促癌的作用。EPIC1是新近发现的一种LncRNA，表观遗传学分析确定它与癌基因

Myc

相互作用，并促进癌症细胞周期的进展，并且在肺癌、胆管癌等肿瘤的核苷酸序列处形成EPIC1-

Myc

复合体，促进

Myc

的转录和翻译，并增强下游MYC、Cyclin A1、CDC20和CDC45等蛋白分子的表达，加速细胞分裂和周期进展，发挥致癌作用。然而EPIC1与PCa的关系尚未有研究报道。

本研究结果显示，EPIC1在PCa细胞系中的表达水平高于正常前列腺RWPE-1细胞系，提示EPIC1对PCa的发生和转移起到一定作用。Li等研究发现，EPIC1能激活MYC蛋白下游的Cyclin A/D、CDK9等靶分子，加速细胞周期G1/S/G2的进程。Zhao等研究发现，EPIC1能够促进MEF2D蛋白复合体的泛素化进而抑制癌细胞的活力和侵袭转移。本研究结果发现，EPIC1在PCa组织中的表达水平高于癌旁正常组织，进而从细胞学和人体组织标本2个层面验证了EPIC1的表达差异，证实了EPIC1对PCa具有促进作用。

本研究采用siRNA技术抑制EPIC1的表达后，发现PCa细胞的增殖和侵袭均明显下降，表明EPIC1具有促进PCa细胞分裂增殖和侵袭转移的功能。目前，对于EPIC1促癌机制的研究主要集中于EPIC1-MYC复合体的功能。研究表明MYC家族蛋白能促进PCa细胞的分裂增殖，并能诱导PCa的激素抵抗性。笔者认为，EPIC1可能在

Myc

基因表达和MYC蛋白功能调控中扮演重要作用，进而对细胞周期产生调控作用，但其具体机制尚需进一步研究。本研究结果显示，癌组织中的EPIC1水平越高，患者的Gleason评分越高、局部淋巴结转移越明显、TNM分期越晚。生存分析发现，EPIC1高表达组患者的存活率低于EPIC1低表达组，表明EPIC1对患者体内PCa细胞的恶性程度和转移能力具有促进作用，同时EPIC1也具有预测患者生存期的作用。一项针对111例晚期乳腺癌患者的研究表明，EPIC1高表达的患者也常合并Ki-67的高表达，易出现早期转移，3年存活率较低，而且对紫杉醇-顺铂化疗方案具有耐药性。笔者将会对前列腺癌化疗耐药与EPIC1的关系进行进一步研究。综合目前文献资料，本研究首次在PCa中研究了EPIC1与患者的生存和预后的关系，表明EPIC1有希望成为判断PCa患者预后的有效的辅助因子。但本研究为单一中心研究，且纳入病例数依然偏少，后续仍需多中心大样本的研究，以进一步发掘EPIC1的作用机制和临床意义。

综上所述，本研究证实了新型LncRNA-EPIC1对PCa的促进作用，EPIC1能提高PCa细胞的增殖和侵袭能力，促进PCa的恶性程度。针对EPIC1的靶向治疗方案有可能成为PCa治疗的新手段。