化学物致癌性体外检测方法研究进展

杨淼，强雨薇，周帆，张驰

(南京市产品质量监督检验院，江苏 南京 210019)

0 引言

肿瘤是危害人民生命健康的最重要的公共卫生问题，在全球约2/3国家和地区前两位的死亡原因都是肿瘤[1]。肿瘤的发生发展是一个正常细胞转变为肿瘤细胞的多阶段复杂过程，是遗传因素和环境因素交互作用的结果，环境因素包括物理因素，化学因素和生物因素，其中化学因素占致癌因素的80%[2]，因此识别化学致癌物是肿瘤防控的首要环节。肿瘤的发生发展有很长的潜伏期，确定化学物是否具有致癌性需要漫长的观察期。长期以来，判断化学物是否致癌性的主要依据是哺乳动物长期致癌试验和人群流行病学调查[3]。但这两种方法耗时长、成本高、效率低、干扰因素多、无法反映致癌机制，难以满足海量化学物大规模快速筛选需要，亟需开发高通量、低成本的体外检测技术，以预测化学物的长期毒性效应，特别是致癌性。现行的化学物致癌性筛选策略往往采取体内体外相结合的组合检测策略，体外试验是体内试验的有效补充，大大缩小致癌体内测试的化学物数量。本文就化学物致癌性的体外检测方法进行综述，为化学物的致癌性的分层及组合筛选提供参考。

1 化学致癌物的分类及致癌机制

世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)将包括单一及混合化学物、职业暴露、环境暴露、物理及生物因素和生活方式在内的致癌因素按照人类致癌性、实验动物致癌性和致癌机制研究证据的权重进行分类。2019年，IARC将致癌因素的分类简化为3类：第1类为人类致癌物，这类物质有充分的人类致癌性和实验动物致癌性证据；第2类又分为很可能的人类致癌物(2A类)和可能人类致癌物(2B类)，2A类物质的人类致癌性证据有限，但在人源细胞或组织中观察到充分的致癌性特征，且在实验动物中致癌性证据充分，2B类物质也具有人类致癌性证据有限、实验动物致癌性证据充分的要求，但不要求人源细胞或组织中有致癌证据；第三类为未分类物质，指那些动物实验和人类致癌性证据均不足，或仅在实验动物中有明确致癌性机制，人类致癌性证据不充分。截止至2020年11月28日，1类致癌因素共121种，2A类致癌因素89种，2B类致癌因素315种，3类为497种[4]。

化学致癌过程是一个复杂的多基因调控的多阶段步骤。按照是否能直接损伤遗传物质，化学致癌物可以分为遗传毒致癌物(Genotoxic carcinogens，GC)和非遗传毒致癌物(Nongenotoxic carcinogens，NGC)。GC指能直接作用于DNA，引起DNA损伤或染色体突变的致癌物，又称为致突变物或诱变剂。遗传毒致癌物作用于体细胞DNA形成DNA加合物，诱导染色体断裂、融合、缺失、错误分离和不分离，引起基因组损伤和信号转导异常，在此基础上突变的细胞无限制地增殖，最终形成肿瘤[5]。常见的GC有苯并芘[6]、N-亚硝基二甲胺[7]、黄曲霉素B1[8]、砷[9]等。GC的检测手段发展较成熟，可以通过一系列的遗传毒性试验进行检测。根据检测的遗传学终点，检测方法可以分为检测基因突变类方法、检测染色体和染色体组畸变类方法、检测DNA损伤类方法。

NGC可以通过各种非损伤DNA的机制诱导肿瘤发生，致癌机制尚未阐明。现有研究认为NGC的致癌机制可能与氧化应激、炎症反应、内分泌调节、肿瘤促进、免疫抑制、表观遗传改变等有关[10]。已证实的非遗传毒致癌物有：佛波酯[11]，苯巴比妥钠[12]，石棉[13]等。NGC不直接作用于DNA并且作用机制复杂，无法采用传统的遗传毒性试验检测，尚无成熟的检测体系。随着对NGC致癌机制的深入研究，对NGC的检测手段也越来越多。Huang[14]等利用体外细胞转化实验结合DNA甲基化检测的方法检测了包含DEHP在内的十种NGC。Schaap[15]等建立了基于小鼠干细胞的毒理基因组学方法，根据NGC特有的基因表达网络区分GC和NGC。

2 化学物致癌性体外检测方法

2.1 遗传毒致癌物体外检测方法

根据不同的毒理学检测终点，发展出了不同的遗传毒性体外检测方法。各国相继颁布了标准和法律法规来规范遗传毒性检测策略，体外检测往往作为组合检测策略的重要一环。近年来，经济合作与发展组织(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)发布并修订了一批遗传毒性检测方法，目前OECD认可的遗传毒性体外检测试验指导原则共10个(TG 471-TG 473，TG 476，TG 479- TG 482，TG 487，TG 490)(https://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicalssection-4-health-effects_ 20745788)。美国环保署(U.SEnvironmentalProtectionAgency，EPA)也制定了一系列有毒物质的毒性检测指南，其中遗传毒性体外检测试验共8个(OPPTS 870.5100，OPPTS 870.5140，OPPTS 870.5250，OPPTS 870.5300，OPPTS 870.5375，OPPTS 870.5500，OPPTS 870.5575，OPPTS 870.5900)。我国卫生部于2005年颁布了《化学品毒性鉴定技术规范》，规范中规定了化学物的毒性检测策略，其中就包含了遗传毒性体外检测步骤和方法。中国检验检疫科学研究院针对OECD的测试准则，建立了部分遗传毒性体外检测方法标准(表1)。下面针对不同遗传终点的代表性检测方法进行简述。

表1 国内外遗传毒性体外检测方法比较

细菌回复突变试验(Ames试验)是应用最广泛的检测化学物诱导基因突变的体外方法，包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验和大肠杆菌回复突变试验[16]。检测原理为组氨酸营养缺陷型菌株在具有诱变毒性的化学物作用下可以回复成野生型，形成肉眼可见的菌落，生成野生型菌株的概率与遗传毒物间存在剂量-反应关系。Ames试验中选用的菌株与检测的突变类型有关，TA1535，TA100，WP2 uvrA，TA102用于检测碱基置换型突变，TA1537，TA97，TA98用于检测移码型突变[17]。Ames试验的优势在于体系成熟，操作简单，试验周期短。缺点是少数不在肝脏中代谢的化学物无法通过Ames试验检测其突变性，部分本身有较深颜色的物质如中药，可能会影响菌落的计数。

染色体异常是DNA损伤的直接表现，微核试验是检测染色体异常的首选方法。在遗传毒致癌物的作用下，染色体丢失或断裂形成的染色体片段在有丝分裂的中后期滞留在细胞质中成为微核，微核数量反映了遗传毒性大小[18]。传统的微核试验采用染色后高倍镜下计数的方法计算微核数量，存在一定的主观性。随着技术进步，科研工作者也对体外微核试验进行了优化和改进。有研究将流式细胞术与微核试验相结合，与显微镜观察相比，流式细胞术分析微核形成率具有高通量，客观和自动化的优势[19]。在使用的细胞载体上也有创新，传统的体外微核试验主要使用CHO、V79、淋巴瘤细胞等细胞，在对化妆品进行体外微核试验时，为了更好地模拟化妆品的暴露途径，开发了基于3D重组人工皮肤模型的微核试验，试验表现出了对遗传毒致癌物良好的预测能力[20]。

检测遗传毒性的另一个重要方法是直接检测DNA损伤，常见的检测技术有：彗星试验，荧光原位杂交，TUNEL，8-OHdG等。彗星试验，又称为单细胞凝胶电泳，是应用最广泛的检测DNA链断裂的体外方法。当DNA在遗传毒致癌物作用下发生链断裂时，在电场作用下，分子量大的核DNA移动速度慢，而断裂的DNA片段移动速度快，形成拖尾类似“彗星”[21]。到目前为止，彗星试验已在超过300个环境和职业暴露研究中应用[22]。有研究利用彗星实验发现了包含农药硫丹[23]、苯及苯代谢物[24]、除草剂[25]在内的多种DNA损伤剂。近期的研究扩展了体外彗星试验常用的细胞株，Amaya[26]等比较了12种化学物分别在HepG2，CHL/IU，TK6细胞株上的表现，发现HepG2细胞是最适宜的体外彗星试验细胞载体。

2.2 非遗传毒致癌物的体外检测方法

如前文所述，非遗传毒致癌物的体外检测一直是致癌物检测的难点和薄弱环节。原因在于a)非遗传毒致癌物不直接作用于DNA，无法应用常规的遗传毒试验检测；b)非遗传毒致癌物的作用机制复杂，不同的致癌物适用不同的检测方法；c)非遗传毒致癌物产生的早期毒性反应多为非特异改变；因此通过体外方法检测非遗传毒致癌物较为困难。

现有研究发现虽然NGC不直接以DNA为作用靶点，但也可能通过间接途径影响DNA复制、RNA转录及蛋白的翻译，产生遗传毒效应，因此部分NGC也可以采用改良的遗传毒试验检测，其中体外细胞转化试验(in vitro cell transformation assay，CTL)是目前最佳的NGC体外检测方案。CTL模拟了体内多阶段的致癌步骤，在区分GC和NGC、解释致癌物在肿瘤发展不同阶段的作用机制等方面有重要优势[27]。Sasaki[28]等将V-Ha-ras基因转染BALB/c 3T3细胞，建立了Bhas 42细胞。利用Bhas 42细胞，Muramatsu[29]等发现了砷主要发挥肿瘤促进的非遗传毒性。OECD在2016年发布了以Bhas 42细胞为基础的两阶段细胞转化试验的指导原则[30]。此外，Kanode[31]等利用TA98菌株应用Ames试验准确地检出了四种非遗传毒致癌物。虽然国内国外多个课题组建立了许多NGC的体外测试方法，但只有CTL法被充分验证，要建立一整套的非遗传毒检测方法体系还有很长的路要走。

2.3 致癌性体外检测方法的最新进展

组学技术在近二十年蓬勃发展，组学技术应用于毒理学领域融合成为毒理基因组学，毒理基因组学为致癌物筛选开拓了新的思路和方法，发现了一批致癌相关生物标志，为致癌物暴露早期评估及高危人群保护提供理论依据。有研究将9种遗传毒致癌物和7种非遗传毒致癌物处理HepG2细胞，对处理后的细胞进行了cDNA芯片分析，筛选出了一批差异表达基因，对表达差异前20位的基因进行集合分析，发现基于不同表达特征的基因可准确筛选出遗传毒致癌物和非遗传毒致癌物[32]。Kawata[33]等在HepG2细胞中评估了致癌物砷、镉、铬、二甲基亚硝胺、佛波酯、四氯乙烯作用下共同基因表达模式，发现癌基因PTTG1可能是致癌物的分子机制上的关键分子。Li[34]等分析了330个化学物在HepG2细胞上的基因表达谱，集合中包含～6000个基因的表达水平，采用随机森林分类法筛选出了基于芳烃受体(AhR)通路的致癌机制。表观遗传调控近年来成为肿瘤研究的热门，miRNA是表观遗传调控主要方式之一，最新研究发现miRNA也可以作为致癌物暴露的生物标志。例如，用BaP处理人支气管上皮细胞后，表达上调的有miR-106a、miR-129、miR-494、miR-498、miR-320，表达下调的有miR-10a、miR-363、miR-493[35]。但组学技术在致癌物筛选中仍有很长的路要走，基于高通量筛选发现的新生物标志和致癌机制尚处于前期研究及验证阶段，这些方法与致癌性之间的关联度有待长期考察。

计算毒理学借助数学模型，根据化学物的化学结构、已知毒理学测试数据和环境暴露数据，实现对未知毒性化学物的毒性预测，已成为大批量化合物毒性预测的首选方法[36]。定量构效关系(Quantitative Structure-activity Relationship，QSAR)模型是计算毒理学中最常见的模型，市面上已有若干商业QSAR平台软件，包括欧盟开发的Toxtree，OECD开发的Toolbox，Accelrys公司开发的TOPKAT，美国EPA开发的T.E.S.T.，Lhasa公司开发Derek等。其中，能预测致癌性的QSAR平台是Toxtree，Toolbox，TOPKAT，Derek。Morales[37]等应用QSAR模型，预测了62个硝基化合物的致癌性。Wedebye[38]等应用16种QSAR预测模型预测了70983种REACH关注物质的遗传毒致癌性，致突变性和发育毒性，结果发现6.5%的化学物具有遗传毒致癌性，16.3%的化学物有致突变性，11.5%为发育毒性物质，与已知的毒理测试数据类似。美国FDA针对膳食中的潜在致癌风险物质开发了计算构效关系模型，以预测有机成分和天然成分的致癌风险，结果发现了19种膳食成分有致癌潜力。此外，这套预测系统也用于预测其他化学物，迄今为止已预测了超过1200种药物，工业化学品和天然产物，预测性能表现良好[39]。但计算毒理学在化学物致癌性预测上也面临困境，以QSAR为代表的预测方法的基础是化学结构，但致癌性是一个相对复杂的评价终点，致癌物往往作用于多个靶点影响多条分子信号通路，现有的模型构建方法识别出致癌物的效能较低。

3 小结

化学物致癌性体外检测的难点主要在于由于致癌机制的复杂性导致单一试验手段预测效能低下，以及海量新化学品带来的筛选压力。将经典试验方法结合高通量技术，制定组合检测策略，采用基于计算毒理学思想预测具有特征结构的化学物毒性或在新致癌机制理论指导下的试验技术对化学物致癌性进行预测和评价将成为可行的解决办法。目前，大多数经典的遗传毒体外试验都可通过结合流式细胞术、高内涵技术或改变计算指标的方法实现自动化和高通量化，部分已被OECD、EPA、FDA等制定为毒性检测指导原则，但非遗传毒体外测试仍处于测试和验证阶段，深入研究化学物的致癌机制将有助于测试方法的开发。此外，组合检测策略已经成为致癌性体外检测的主要趋势，在化妆品、药品、食品等领域已分别制定了相应的检测规范。本文梳理了化学物遗传毒性和非遗传毒性的试验方法，为致癌性检测和评价提供借鉴思路。