基于网络药理学的滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎机制研究

张珅，张磊

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430014；2.武汉市中医医院骨伤科,湖北 武汉 430014)

0 引言

膝关节骨性关节炎是临床上最为常见的、以关节退变为基础的疾病，特征为关节间隙变窄、滑膜增厚、软骨退变、骨质增生，导致出现膝关节肿胀疼痛，活动受限等症状[1]。目前，西医治疗膝骨性关节炎的保守治疗手段以口服消炎止痛药、软骨保护药物、物理治疗、关节腔内注射药物为主。虽有部分短期疗效，但长时间口服抗炎止痛药，可能会出现消化道溃疡、出血、胃肠道穿孔、肝肾损伤等不良反应[2]。中医认为本病应属“骨痹”之范畴。本病病因病机为肝肾亏虚，气血亏虚或慢性的长期劳损导致筋脉失于濡养，风、寒、湿等外界邪气侵袭人体致使筋脉不通，气血瘀滞而痛。以肝肾亏虚为本，气滞血瘀、感受外邪为标[3]。相比于西医保守治疗常规口服药的局限性，中医的外治法往往可以体现出独特优势。

滑膜炎膏是由武汉市中医医院骨科自行研制，以制草乌，制川乌，制南星，甘松，山柰，玄胡，细辛打成细粉后，将药粉用酒调和后外敷用的外用中药膏剂。本研究采取网络药理学的方法分析滑膜炎膏治疗膝关节骨性关节炎的分子作用机制，用数据库筛选滑膜炎膏中包含的活性化合物及其作用靶点，并加以分析，构建“活性成分-靶点”网络，对信号通路进行分析，从分子层面预测药物的作用机制，为滑膜炎膏的临床运用和进一步研究提供理论支撑。

1 方法

1.1 收集并筛选滑膜炎膏中的化合物

借助TCMSP数据库分别以“川乌”“草乌”“天南星”“甘松”“山柰”“细辛”“玄胡”为关键词检索滑膜炎膏的化合物成分。基于已有文献研究，以类药性≥0.18为标准，对药物成分进行筛选，筛选出制草乌，制川乌，制南星，甘松，山柰，玄胡，细辛中符合标准的活性成分。

1.2 靶标蛋白的筛选和活性成分-靶点网络的构建

将从滑膜炎膏中筛选所得到的活性成分在TCMSP数据库中进行检索，查找对应靶标蛋白，在Uniprot数据库中查询靶标蛋白所对应的基因名，将多余或重复的靶点删除。利用Cytoscape3.7.2构建“活性成分-靶点”网络并对其中的化合物和作用靶点加以分析。

1.3 预测滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎潜在作用靶点

在Genecards数据库[4]中检索与“Knee Osteoarthritis”相关的基因，获得膝骨性关节炎相关疾病靶点。对1.1中的活性成分靶点与疾病基因靶点取交集，获得的交集靶点即为滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的潜在关键靶点。

1.4 构建PPI网络并分析

用String数据库[5]构建蛋白相互作用网络，将“1.3”获得的潜在关键靶点导入数据库，设置物种“Homo Sapiens”，获取蛋白之间的PPI网络，以TSV格式保存，将TSV文件导入Cytoscape3.7.2，利用“Network Analyzer”功能分析后得到滑膜炎膏发挥药理作用的关键靶点。

1.5 靶点的通路分析

将交集靶点导入DAVID数据库，设置P<0.05，物种设置为“HomoSapiens”，将靶点基因的名称修正为官方名称(Official Gene Symbol)，分别进行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析选取生物过程(Biological Processes，BP)，细 胞 功 能 (Molecular Function，MF)，细 胞 组 分(Cell Composition，CC)，用Omic Share云平台中的绘图工具，按照富集的靶点数排序并选取主要条目，绘制气泡图。

2 结果

2.1 筛选滑膜炎膏中的活性化合物

通过 TCMSP 数据库检索得到滑膜炎膏中化合物共521个，其中12个来自川乌、27个来自草乌、123个来自天南星、57个来自甘松、33个来自山柰、192个来自细辛、77个来自玄胡。根据DL≥0.18的标准，筛选得到符合标准的化合物共156个，化合物中7个来自川乌、15个来自草乌、34个来自天南星、12个来自甘松、2个来自山柰、15个来自细辛、71个来自玄胡。表1是滑膜炎膏中部分活性化合物的基本信息。

表1 滑膜炎膏中部分活性化合物的基本信息

2.2 构建活性成分-靶点网络并分析

利用Cytoscape3.7.2软件构建如图1所示的滑膜炎膏中活性成分-靶点网络。该网络共包含节点311个，药物节点7个，活性化合物节点156个，基因靶点节点148个，共3053条边。图中滑膜炎膏中的药物用红色圆形表示，筛选出滑膜炎膏中的活性化合物用蓝色三角形表示，靶点基因用绿色菱形表示，每种药物与活性化合物的包含关系、活性化合物与靶点基因之间存在相互作用关系用彼此间的连线表示。对活性成分和靶点的中心度值进行分析并排序，排在前5的活性成分为Quercetin(槲皮素)、Kaempferol(山柰酚)、β-Sitosterol(β-谷甾醇)、Stigmasterol(豆甾醇)、Coumarin(香豆素)。靶点方面，排名前5的分别是ESR1、F2、AR、PTGS2、NOS2。

续表1

图1 滑膜炎膏中活性成分-靶点网络

2.3 滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎潜在作用靶点的预测

在GeneCards数据库检索后，得到1772个膝骨性关节炎的潜在靶点。运用Venn在线平台绘制Venn图，将膝骨性关节炎的潜在靶点与滑膜炎膏中活性成分靶点映射并取交集，获得68个滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的潜在作用靶点，见图2。

图2 滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎潜在靶点Venn图

2.4 构建滑膜炎膏的PPI网络并分析

滑膜炎膏的PPI网络见图3，在STRING数据库中，输入滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的潜在靶点基因，构建蛋白相互作用网络。网络中共包含68个节点，785条边。其中超过平均节点度值(23.08)的靶蛋白有32个，利用Cytoscape3.7.2软件筛选出这些关键节点，见图4。

图3 滑膜炎膏“蛋白质-蛋白质”相互作用网络图

图4 网络关键节点

2.5 靶点的GO富集分析及KEGG通路分析

通过DAVID数据库对潜在靶点进行分析，共得到GO富集条目437个(P<0.05)，其中包括317个生物过程、52种细胞功能和68类细胞组分。选取排名前20的GO条目制作气泡图。GO注释多与BP和MF有关，如细胞代谢、增殖凋亡、炎症反应、氧化还原酶活性、过氧化物酶活性等。

KEGG通路富集分析筛选后获得80条 (P<0.05)信号通路，主要涉及HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)、血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)、类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、破骨细胞分化(Osteoclast differentiation)、鞘脂信号通路(Sphingolipid signaling pathway)、雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。选取富集基因前20条的通路绘制相应气泡图，见图8，X轴代表所占百分比，Y轴代表通路名称，气泡的面积大小代表通路富集基因数。

图5 滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的BP富集气泡图

图6 滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的MF富集气泡图

图7 滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的CC富集气泡图

图8 滑膜炎膏治疗膝关节骨性关节炎的KEGG富集气泡图

3 讨论

膝关节骨性关节炎作为一种临床中常见骨科疾病，主要表现为关节间隙变窄，软骨磨损和破坏，骨质增生及关节腔积液形成等。目前西医的非手术治疗首选口服止痛药非甾体类抗炎药，如果长时间口服抗炎止痛药，存在消化性溃疡、心血管危害、肝肾损伤等风险，且远期疗效不理想[2]。中医认为，膝骨性关节炎在中医学中属“痹症”范畴，本病多因肝肾亏虚，气血亏虚或慢性的长期劳损导致筋脉失于濡养，风、寒、湿等邪气侵袭人体致使筋脉不通，气血瘀滞。以肝肾亏虚为本，气滞血瘀、感受外邪为标。本院自制滑膜炎膏由临床应用多年的中药验方改良而来，其中川乌草乌性辛热、除风湿，温经通络，且止痛作用强；天南星辛温燥烈，长于除经络中之风痰湿浊，还可消肿散结；甘松外用可祛湿消肿；《岭南采药录》记载：山柰，治跌打伤，又能消肿。玄胡苦辛性温，行气活血，擅长止痛；细辛辛香温散，祛风散寒，除湿止痛。以上诸药以酒调制，取其辛散温通之性以助药势，并可加强活血通络之功，引诸药直达病所。本方具有祛风寒、除湿痹、消肿止痛之功，且为外用药物，不会产生胃肠道不良反应、加重肝肾负担。

本研究采取网络药理学方法检索并筛选，得到滑膜炎膏中包含化合物521个，156个活性成分，148个作用靶点，68个治疗膝骨性关节炎潜在作用靶点，其中度值排在前5的有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、香豆素。槲皮素的药理作用主要包括抗炎、保护骨关节、抗细胞凋亡、抑制破骨细胞吸收等[6]。贾庆运等[7]发现槲皮素可明显改善CIA小鼠的关节肿胀症状，且能有效减轻关节破坏、降低关节炎症指数而不产生肝损害。此外槲皮素可减轻细胞炎性因子表达，保护关节软骨[8]。WONG等[9]通过一项体内外研究发现，山柰酚主要是通过抑制脂肪生成、炎症反应、氧化应激、破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡等一系列方式达到骨保护作用。此外动物实验发现，山柰酚能有效控制CIA小鼠模型滑膜炎症[10]；β-谷甾醇可以发挥良好的抗氧化、抗炎和调节免疫作用[11]。曾莉萍[12]等研究发现β-谷甾醇能够有效地提高成骨细胞护骨素(OPG)与破骨细胞分化因子(ODF)的比值，可以起到调节骨代谢平衡作用。研究表明，豆甾醇具有抗炎镇痛、抗氧化等作用[13]，Chen等[14]通过评估家兔的膝骨性关节炎模型发现，豆甾醇能明显抑制软骨降解和MMPs的表达，证明了豆甾醇在治疗膝骨性关节炎方面的存在潜力。香豆素及其衍生物具有较好的药理活性，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌以及抑制酪氨酸酶等生物活性，除此之外，一部分香豆素类化合物还表现出了镇痛的活性[15]。

通过对滑膜炎膏与膝骨性关节炎共同靶点的PPI网络进行网络拓扑分析发现，滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的主要靶点包括IL-6、IL-1β、TNF、VEGFA、MAPK1等靶点。IL-6和IL-1β为重要炎性细胞因子，研究显示TNF和IL-6参与调节炎性反应，是骨关节炎发病过程中的主要介质[16]。Neide[17]等在研究中发现，IL-6与关节液中胶原酶(破坏软骨基质的主要酶类)的浓度相关性较高。IL-6可以促进淋巴细胞分泌免疫球蛋白，进一步使炎症加重。除此之外，IL-6可以与IL-1协同，通过抑制软骨细胞中蛋白聚糖的合成致使软骨基质缺失。由此可推断，IL-6可加重关节软骨的破坏以及关节炎症的发展。研究表明，VEGFA会促进MMP-1和MMP-3表达，破坏关节软骨[18]。VEGFA在骨关节炎的发生发展中参与了诸如滑膜增生、软骨基质降解、软骨下骨硬化及骨赘生成等重要病理过程[19]。MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)家族中包括了erk1/2、jnk1/2和p38。它们由双磷酸化激活，参与了细胞增殖、分化、凋亡和炎症反应[20]。

从靶点的GO富集分析可看出，主要涉及到了细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应等生物过程，这些生物过程可能在滑膜炎膏对膝骨性关节炎的治疗中起到了较关键的作用。KEGG通路富集分析显示，滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的潜在作用靶点主要涉及HIF-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、血管内皮生长因子信号通路、类风湿关节炎、MAPK信号通路等。这些信号通路主要涉及MAPK和TNF。MAPK与PI3K-Akt同属破骨细胞分化信号通路，该通路可以通过调节、控制成骨细胞和破骨细胞间的平衡，影响疾病发展[21]。MAPK信号通路能够通过使成骨细胞中相关转录因子抗体磷酸化来调控其基因表达，进而影响成骨细胞的分化及凋亡[18]。PI3K-Akt信号通路可控制软骨细胞的增殖分化，使软骨细胞的丢失减少、关节内软骨层的脱落减轻，进而改善骨关节炎的症状[22]。肿瘤坏死因子信号通路中的TNF-α可刺激滑膜成纤维细胞增生，产生金属蛋白酶，激活B细胞生成自身抗体，会加重关节软骨的破坏[23]。

综上，本研究基于网络药理学方法分析了自制滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的机制，从分子层面阐释了该方的药理机制可能是以多成分、多靶点、多通路的整体调节方式，通过调节细胞增殖与凋亡、炎症反应以发挥治疗作用，也为本方的临床运用和进一步开发提供了理论支撑。但本研究仍存在局限性，首先，中药膏剂的制作工艺尚未有严格的量化标准，药物的纯度测定等也有待完善。其次，由于所选数据库的数据不一定完全，忽略了药材中的成分含量、药物成分之间的相互作用、药物经皮吸收率等影响因素，因此滑膜炎膏治疗膝骨性关节炎的具体机制还有待进一步研究和实验验证。