薯蓣皂苷元对脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型的保护作用

王婧雯，李昌泽，徐玮臻，华叶婧，王桐桐，谷婉莹，郑荟，隋宏书*

(1.山东第一医科大学基础医学院，山东 泰安 271000；2.山东第一医科大学组织学与胚胎学教研室，山东 泰安 271000)

0 引言

脊髓缺血后再灌注损伤(Spinal Cord Ischemia Injury，SCII)的病理过程是脊髓修复和功能重建的瓶颈，由于目前尚无有效治疗手段，常导致不可逆性肢体功能障碍，影响患者的身心健康。引起脊髓缺血再灌注损伤的病理因素是复杂的，脂质过氧化、钙离子蓄积、细胞凋亡以及炎症反应等因素均可导致SCII的发生[1]。薯蓣皂苷元(diosgenin)是一种从茄属植物和薯蓣属植物中获得天然留体皂苷配基，具有抗氧自由基、对抗钙超载和抑制细胞凋亡的作用[2]，目前临床多利用其抗炎作用生产甾体激素类药物如氢化可的松、地塞米松等[3]。但是，关于薯蓣皂苷元在大鼠的脊髓缺血再灌注损伤模型中的保护作用尚未见报道。鉴于此，本项目拟通过手术建立大鼠SCII模型，探究薯蓣皂苷元对脊髓组织氧化损伤的保护程度。同时通过分子生物学等技术探究该保护作用的具体分子机制，为临床上治疗SCII提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验药品与仪器

丙二醛检测试剂盒购自深圳子科生物科技有限公司，超氧化物歧化酶的检测试剂盒购自上海瑞番生物研究所，薯蓣皂苷元购自成都化夏化学试剂有限公司。UV1000紫外/可见分光光度计(济南千司生物有限公司)；恒温水浴锅(山东博科生物产业有限公司)。

1.2 实验动物

30只5 周龄雄性SD大鼠(250～280g)，购自济南朋悦实验动物繁育及生物技术研究所。动物房通过控光实现12h光照-黑暗循环，保持良好通风及适宜室温(23～26℃)。本实验所用动物的饲养程序均符合国家《实验动物管理条例》的各项标准和山东第一医科大学动物管理委员会伦理指南。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠SCII模型的建立

30只5 周龄雄性SD大鼠随机分为三组：假手术组、SCII组、干预组。采用10%水合氯醛，2mL/kg进行腹腔注射，将大鼠侧卧固定，备皮后使用75%酒精消毒，在大鼠左侧肋弓下缘中线做切口，沿左肾和左肾动脉寻找腹主动脉，假手术组只暴露并游离腹主动脉，SCII 组及干预组于肾动脉以下用动脉夹持续夹闭45min。完全阻断腹主动脉血流的标志是感受不到股动脉搏动及大鼠双后肢出现发绀冰凉现象。实验中需使用烤灯维持大鼠体温，并用生理盐水湿敷。缝合创口后肌注青霉素以预防感染。

1.3.2 给药及取材方法

大鼠SCII模型建立30min后，干预组予以100mg/kg薯蓣皂苷元灌胃，假手术组和SCII组腹腔灌胃等体积0.9%的生理盐水。于血液再灌注24h后观察清醒大鼠的后肢运动情况并评分，处死大鼠并取腰段脊髓称重检测。切取脊髓组织时大鼠取俯卧位，于腰背正中做切口，由浅入深经皮肤、筋膜至大鼠脊椎，由脊椎棘突分离附近肌肉，使用咬骨钳等工具尽量完整取出L1-4的脊髓待测。

1.4 检测指标

1.4.1 大鼠脊髓组织病理学改变

取腰段脊髓做HE染色切片，由非本实验成员且熟悉脊髓切片的观察者于显微镜下观察，比较评估各组脊髓组织病理学结构特征及差异。正常神经元判断标准：细胞外形轮廓清晰、细胞核及尼氏体染色均匀。

1.4.2 大鼠后肢运动功能评分

术后24h根据脊髓损伤评分标准(BBB)对各组大鼠后肢的运动功能进行比较，重点观察大鼠后肢各关节运动情况和行走步态。0～7分：评价大鼠后肢的关节运动功能；8～13分：评价大鼠整体协调运动及行走步态；14～21分：评价大鼠爪子的精细运动情况。评分采用双盲制，即每次分别由经过学习培训后的两人独立完成，最终数据取两人平均值。

1.4.3 氧化应激指标检测

取腰段脊髓加入9倍体积的盐水制成10%的匀浆，3000r/min离心10min，取上清液，采用分光光度法测定脊髓组织匀浆中 SOD的活性和MDA的含量，根据氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)光还原法测定SOD活性；根据硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法测定MDA含量。其余详细测定步骤参考两者试剂盒内的说明书。

1.5 统计方法

处理实验数据时使用SPSS 17.0软件，按照(mean±SEM)的格式记录数据。两组间数据比较时用独立样本t检验；多样本间数据比较时用单因素方差分析，当涉及多重数据比较时用LSD方法。如果所得实验数据不符合应用单因素方差分析的条件，则应用秩和检验法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠脊髓组织病理学变化

假手术组镜下细胞外形正常，核仁、尼氏体可见，组织中未见出血、水肿。SCII组可见大量神经元细胞固缩、坏死，胶质细胞增生，灰质出血以及中性粒细胞浸润。干预组可见神经元细胞结构清晰，部分细胞核仁可见，空泡形成相对较少，未见明显出血。

图1 三组大鼠脊髓组织HE染色切片

2.2 大鼠后肢运动功能评分

由BBB评分法比较各组大鼠后肢的运动功能，重点记录大鼠后肢各关节运动情况和行走步态(详见表1)。

表1 手术后24h大鼠后肢运动功能评分(n=10, mean±SEM)

数据显示假手术组大鼠后肢未出现瘫痪。SCII组和干预组大鼠的后肢均出现不同程度的瘫痪。与假手术组相比，SCII组BBB评分显著降低(19.33 vs 6.00，P<0.05)，提示造模成功。干预组的BBB分值相比假手术组也相应降低(13.33 vs 19.33，P<0.05)，但明显优于SCII组(13.33 vs 6.00，P<0.05)，提示使用薯蓣皂苷元干预可明显改善大鼠后肢运动情况。

2.3 大鼠脊髓氧化应激指标

图2所示，与假手术组相比，SCII组和干预组大鼠脊髓组织中SOD水平均降低(6.34 vs 2.73，4.12，P<0.05)，MDA水平均升高(3.90 vs 9.80，6.63，P<0.05)，差异有统计学意义，提示造模成功。与SCII组相比较，干预组大鼠脊髓组织中SOD水平显著升高(2.73 vs 4.12，P<0.05)，MDA水平显著降低(9.80 vs 6.63，P<0.05)，差异有统计学意义，提示使用薯蓣皂苷元干预可以改善脊髓组织氧化应激造成的损伤。

图2 手术后24hSOD和MDA活力水平

3 讨论

脊髓损伤作为一种严重的外科疾病，对人们生活质量造成严重威胁，其中缺血再灌注造成的损伤致残率、且致死率较高。前期研究发现脊髓组织较其他组织中含有较多不饱和脂肪酸，因此对氧自由基介导的脂质过氧化较为敏感，也更易受到自由基破坏。因此国内学者普遍认为氧化应激是引起脊髓缺血再灌注损伤的重要病理机制之一，研究利用具有抗氧化作用的药品拮抗氧自由基已成为研究的热点，比如右美托咪定[4]等。

本研究通过手术持续夹闭大鼠腹主动脉45min，构建脊髓缺血再灌注模型，并用100mg/kg的薯蓣皂苷元进行干预治疗。实验以超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平作为检验脊髓组织氧化损伤程度的指标，探究薯蓣皂苷元的抗氧化功能在脊髓损伤中的保护作用。脊髓组织病理切片显示，SCII组神经元细胞固缩、坏死，可见大量空泡。根据脊髓损伤评分标准评分，SCII组和干预组大鼠均出现后肢功能障碍，表明大鼠SCII模型构建成功。实验数据说明，与假手术组相比，SCII组和干预组的SOD活性均降低，MDA水平均升高，这与叶劲涛等[5]的研究一致，考虑其原因可能为：血液再灌注时，氧自由基增多抑制超氧化物歧化酶等多种内源性抗氧化酶活性，使其失去对氧自由基的清除能力；氧自由基增多还可引起脂质过氧化反应，丙二醛作为脂质过氧化的终产物相应增加，破坏细胞膜和线粒体的功能。与SCII组相比，使用薯蓣皂苷元干预后，大鼠脊髓组织中SOD活性提高，MDA水平降低。通过处理BBB评分，证明干预组大鼠后肢运动功能显著改善，以上均提示薯蓣皂苷元具有减轻脊髓损伤的作用。

综上所述，薯蓣皂苷元对脊髓缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，机制可能为薯蓣皂苷元通过抗氧化作用，减轻缺血再灌注所致的脊髓组织氧化应激损伤。薯蓣皂苷元的来源较广，具有一定的临床应用价值，但有关薯蓣皂苷元改善脊髓损伤功能的具体细胞信号转导机制还需进一步探讨。