基于FT-ICR质谱仪的光解离光谱自动化谱图采集程序的开发与应用

2021-08-17张凯林石莹莹李树奇马利福张先燚孔祥蕾

光谱学与光谱分析 2021年8期

张凯林, 周敏, 石莹莹, 李树奇, 马利福, 张先燚*, 汪曣, 孔祥蕾, 4*

1. 天津大学精密仪器与光电子工程学院, 天津 300072 2. 南开大学化学学院，元素有机化学国家重点实验室，天津 300071 3.安徽师范大学物理与电子信息学院，安徽芜湖 241000 4.南开大学化学科学与工程创新中心，天津 300071

引言

随着质谱技术和激光技术的发展，“Action Spectroscopy”(“行动光谱”)的方法已经成为气相离子化学研究中最有优势的方法之一[1-6]。在这类实验中，光谱数据是通过对逐一改变激光波长所记录的质谱信号变化来进行推导得到的，这也使目标离子的浓度不再是离子光谱获取的关键因素。一方面，该方法的研究对象具有超强的延拓性，从小分子以及其相关的团簇分子延伸到生物分子及其相关化合物分子；另一方面新的仪器和方法也可以及时被引入，如目前可使用的不同类型可调谐激光器，其波长范围可从紫外波段覆盖到红外波段。而装备了不同类型离子源和质量分析仪的质谱仪也在不停地发展和更新中[1-2, 7-8]。

随着高分辨质谱分析和光解离光谱分析等方法的快速发展，也出现了一些问题亟待解决。例如，在针对离子的光解离光谱实验中，随着激光的可调谐范围变得越来越宽，越来越多的质谱和光谱数据需要进行采集和分析，会急剧增加工作量和时间。为了解决这一问题，不同课题组采用了不同的方法。如FELIX自由电子激光实验室使用自编的控制软件通过Bruker TrapControl程序自带的XML脚本接口以及质谱仪的硬件控制辅助接口实现对激光及质谱仪的控制[9]；有研究使用Labview通过激光器以及质谱仪的辅助接口实现光解离光谱的获取[7]；有研究使用Bruker公司的Amazon SL离子阱质谱仪，借助商业软件预留的SpectraScan LabView接口实现光解离光谱的扫描[10]。考虑到不同研究小组的研究平台和仪器有着非常大的差别，同时向仪器制造商定制非标准软件产品在很多情况下都不现实，所以非自动化采集数据的做法依然广泛地存在于众多实验室中。这些数据的采集工作不仅耗费人力和时间，还会在实验中不可避免地产生人为错误，降低了数据的可靠性和可比性。

另一方面，收集的大量实验数据中也包含很多相关的结构信息，以及所研究体系的光谱与动力学信息，但这些信息通常很难直接得到体现。即使一些用于质谱数据分析的商业软件可供选择，但受数据格式转换、分析模型、分析目标以及其价格等多方面因素的制约，这些软件也很难直接应用到实际研究之中。同时在数据分析和处理方法中存在很多新的科学问题，因而急需开发出针对用户实际需要的数据分析方法和相应的软件是急需的。

本研究开发了用于光解离光谱分析的软件程序，并与本实验室近期搭建的光解离光谱实验平台进行了集成，其中包括一台FT-ICR质谱仪以及两台由不同厂商制造的可调谐OPO激光器。目的在于实现光解离质谱数据的自动采集，并实现光解离光谱实验数据的自动分析。该软件的可行性已经在实际应用中得到了展示，其中数据分析的过程也极大地提高了实验效率。

1 实验部分

1.1 样品

Tetraphenylporphyrin(TPP)在艾览(上海)化工科技有限公司购买，tetra(4-carboxypheyl)porphyrin(TCPP)在北京伊诺凯科技有限公司购买，tetra(4-aminophenyl)porphyrin(TAPP)在天津希恩思生化科技有限公司购买。这些分子的结构如图1所示。所有样品没有经过任何前处理。为在串联质谱实验中得到稳定的离子信号，对不同样品的溶液配比及浓度进行了优化。TPP以10 μmol·mL-1的浓度溶解在配比为二氯甲烷∶乙酸=98∶2的溶液中； TCPP以5 μmol·mL-1的浓度溶解在配比为甲醇∶乙酸=98∶2的溶液中TAPP以1 μmol·mL-1的浓度溶解在配比为二氯甲烷∶甲醇∶乙酸=49∶49∶2的溶液中。

图1 三种不同取代基的卟啉类化合物(a)： 4苯基卟啉； (b)：四对羧基苯基卟啉；(c)：四对氨基苯基卟啉Fig.1 Three species porphyrins compoundswith different substituents(a)： TPP； (b)： TCPP； (c)： TAPP

1.2 装置

所使用的装置已在之前的工作中做出过较详细的说明[2, 11-12]，在此只做简单说明。如图2所示，光解离光谱使用一台7.0 T傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)质谱仪结合两台可调谐激光器获得。电喷雾离子源(ESI)的探针电压设置在2.8 kV用于将样品电离。2台可调谐激光器被集成在系统之中：第一台为桌面式可调谐OPO(EKSPLA, NT-342C, 立陶宛)，其输出的激光可调谐范围为192～2 600 nm；另一台可调谐激光器为可产生2 600～3 700 nm红外激光的桌面式OPO(Msquared Firefly-IR，英国)。目标离子使用“Stored Waveform Inverse Fourior Transform” (SWIFT)的方法进行选择。紫外-可见激光(单脉冲能量约为1～1.5 mJ，实验在210～700 nm波段内进行扫描)的光路与ICR分析池同轴，穿过一个CaF2窗口法兰被引入到ICR分析池中用以光解离实验。两台激光器的光路可通过改变光学真空腔内其所对应反射镜的位置进行切换[11]。激光照射时间为2 s使用一个机械快门(Sigma-Koki, 日本)进行控制，其控制信号由FT-ICR质谱仪的内部时序提供。实验数据全部通过自主开发的程序进行控制而获得。

图2 实验装置Fig.2 A Picture of the experimental setup

2 结果与讨论

2.1 AutoMS程序设计

AutoMS程序由彼此独立的两个部分所组成。第一部分AutoSpecMS用于自动数据采集；第二部分AutoDataMS用于自动数据分析。两部分程序可以彼此独立运行。

AutoSpecMS使用Python语言进行编写，是一种面向对象编译的脚本语言。其所需要解决的关键问题是在Windows操作系统下将三台产自不同厂商的商业仪器有序地集成在一起，并自动地获取光解离质谱与光谱数据。三台商业仪器分别为7.0 T IonSpec FT-ICR质谱仪、 EKSPLA NT-342C 可调谐OPO(激光覆盖范围192～2 600 nm)以及Msquared Firefly可调谐OPO(激光覆盖范围2 500～3 700 nm)。为解决上述问题，两台激光器和一台质谱仪分别抽象化成类(class)对象OPO_NT，OPO_Firefly和FT_MS。当在主程序中调用它们时，分别进行实例化，从而实现控制。在与商业仪器进行通讯的过程中，主要采用Python语言的pywin32扩展库及selenium扩展库，分别实现NT-342C激光器控制软件，傅里叶变换离子回旋共振质谱仪控制软件及Firefly-IR激光器网页控制软件的通讯。

AutoSpecMS程序的流程图如图3(a)所示，在此做以简要说明：

(1) 用户设置采集光谱的波长范围(a1,a2)，并初始化变量i的值为a1;

(2) 判断i的值是否小于a2，若小于a2，则执行步骤(3)，否则执行步骤(9)；

(3) 与激光器建立通讯，并实现控制；

(4) 设置激光器波长的值为inm;

(5) 与7.0 TFT ICR MS 建立通讯，并实现控制；

(6) 采集波长inm下的光解离碎片离子质谱图；

(7) 以特定的文件名称自动保存步骤(6)中采集的质谱图至用户指定的文件夹；

(8) 更改i的值，令i=i+1，并执行步骤(2)；

(9) 关闭激光器，结束数据采集。

图3 程序流程图(a)： AutoSpecMS； (b)： AutoDataMSFig.3 Software design flow charts(a)： AutoSpecMS； (b)： AutoDataMS

AutoSpecMS程序可以根据用户的需要自动采集大量串联质谱数据。例如，如果需要获取某些分子在211～710 nm波段，扫描步长为1 nm的紫外-可见光解离光谱，需要采集总共500张高分辨质谱。如果实验需要在每个波长下重复3次以获得实验的误差阈值，那么总共的质谱采集数据则为1 500张。不同于其他质谱仪，FTICR质谱仪的数据量大，计算机处理速度是比较慢的。而这样大量的高分辨质谱数据的分析需要耗费巨大的人力。同时在长时间的重复实验当中，人为引入的错误很难被发现。因此对数据进行自动化分析是不可或缺的。程序的第二部分AutoDataMS就是为了达到此目的而设计的，这部分程序使用MATLAB进行编写，其程序流程如图3(b)所示，主要的步骤为：

(1) 用户设置源文件路径，光谱强度数据保存的路径及文件名，信噪比，采集光谱的波长范围(a1,a2)，并初始化变量i的值为a1;

(2) 判断i的值是否小于a2，若小于a2，则执行步骤(3)，否则执行步骤(9)；

(3) 对inm的时域质谱信号数据进行快速傅里叶(FFT)变换，得到质荷比对应强度信息的质谱图；

(4) 对步骤(3)得到的质谱图进行噪声信号的评定;

(5) 获取inm质谱图中满足信噪比要求的碎片离子强度值；

(6) 根据式(1)算出inm目标离子的光谱强度值

(1)

式(1)中If表示碎片离子的强度值，Ip表示母体离子的强度值；

(7) 保存inm质谱图中的碎片离子强度值以及光谱强度值；

(8) 更改i的值，令i=i+1并执行步骤(2)；

(9) 绘制光谱图，结束数据处理。

为了使用户便于操作，实现数据分析过程的可视化，本研究使用MATLAB的GUI编程语言进行了人机交互界面的编写。如图4所示，人机交互界面被分为参数设置区、功能区和结果显示区。图中左侧部分为参数设置模块，包括源文件名称、质荷比范围、激光扫描范围、扫描步长、信噪比阈值、母离子质荷比、质谱仪采样频率以及输出文件名等。图中右侧区域为用于结果的展示模块，将数据可视化的展现给用户，方便用户浏览实验结果。图中以一个3D光谱为例，作为展示结果，实验波长扫描范围为210～700nm，质荷比范围为m/z400～630。其中所有的质谱和光解离光谱数据都可以被保存成为常规数据文件，方便使用其他分析软件进行下一步处理，比如Origin或Excel。

图4 AutoDataMS程序界面Fig.4 The interface of the AutoDataMS program

2.2 实验结果

为证明上述软件程序的可行性，选取了几种卟啉衍生物分子，开展了光解离质谱和光谱实验。作为一类大共轭体系的分子，卟啉类分子在集光、能量、电子转移反应和催化等方面有着非常重要的作用，并受到广泛关注。卟啉及其衍生物分子具有很强的光吸收和光致发光性质，其分子结构及化学性质也被众多专家、学者所研究[13]。例如，Seo等利用离子迁移质谱仪结合红外多光子解离光谱的方法研究了Protoporphyrin IX早期聚合物的结构等性质[14]。Chen等使用177 nm纯固态深紫外激光发现TPPs的电离能可达7.0 eV[15]。Jäger等使用一台商业FT-ICR质谱仪(Bruker Apex Ⅱ)结合一台纳秒脉冲OPO，研究了不同种类M(Ⅱ)-meso-tetra-(4-sulfonatophenyl)-porphyrin (M=Pd, Cu和Zn)化合物在410～650 nm波段内的“action”光谱[16]。

实验中，波长扫描范围为210～700 nm，扫描步长为2 nm。利用AutoSpecMS实现了质谱数据的自动获取和保存。在FT-ICR质谱上采集每张光解离质谱图所需要的时间大概为13s，每种化合物的光解离光谱实验在无人为干预的情况下可在1 h内完成。

图5展示了质子化的TPP，TCPP和TAPP紫外-可见波段的光解离光谱。三种化合物的离子在420～460 nm波段内都出现了较明显的吸收。TCPP的吸收在紫外波段内的吸收最强，且吸收带也是最宽的，其余两种化合物在此波段内的吸收与TCPP相比较弱。在500～650 nm波段内，TPP和TCPP都有很强的吸收，但是TCPP的吸收带要明显窄于TPP，然而TAPP与另外两种化合物相比在此波段内只可观察到很弱的吸收。由实验光谱可得出结论，卟啉类分子的紫外-可见光谱可因其取代基不同而进行区分。

图5 三种不同离子的紫外-可见光谱(a)：质子化TPP； (b)：质子化TCPP; (c)：质子化TAPP

图6 三种离子在不同波长激光照射下的光解离质谱(a)，(b)和(c)分别为质子化TPP，TCPP和TAPP在433 nm激光照射下采集； (d)，(e)和(f)为别为三者在550 nm激光照射下采集Fig.6 Photodissociation mass spectra of selected ions obtained at different wavelengths(a), (b) and (c) are the mass spectra of protonated TPP，TCPP and TAPP obtained with laser irradiation at 433 nm, while (d), (e) and (f) are ones obtained with laser at 550 nm, respectively

进一步观察三种化合物在433和550 nm处的光解离质谱[如图6(a—f)所示]，发现三种化合物在这两个波长的激光照射下都有很多不同的光解离通道。需要说明的是，以图6(a)为例，图中可看到解离峰都是由一簇峰组成，每簇离子峰由其同位素峰以及-H峰及-2H峰组成。由于图中的空间有限，其他图中的离子峰簇仅指认出最强的离子峰。每个被指认出的碎片离子峰使用其对应的符号及其所对应的质荷比进行标识。图6(a)和(d)分别为TPP在433和550 nm激光照射下的光解离质谱。为使所展示出的质谱图易于解读，不同的解离碎片使用不同的图形符号来代替，其注释被标注在图6的顶端。图中两个波长下的光解离质谱，可以明显地显示出其光谱中所对应的强吸收，这些碎片离子包括很多自由基离子。图6(b)和(e)为TCPP的光解离质谱，可以明显看出其在433 nm处的光解离碎片从离子强度和种类，数量上皆大于TPP。而对于质子化的TAPP，在433 nm处可观察到很强的碎片离子且强度较大，但当激光调谐到550 nm时，只可观察到较弱的碎片离子。

本文所述的软件程序不仅可获得目标离子的光解离光谱，同时也可以获得单通道的光解离碎片离子产率谱。碎片离子产率谱既反映了单个光解离碎片离子随激光波长变化的强度变化，又反映了相应的解离通道对总光谱的贡献。图7显示了这三种化合物的某些光碎片离子的单通道光谱。

除此之外，如图4所示的3D紫外-可见光谱也能以2D的形式展现出来。图8为所涉及的三种卟啉衍生物分子的2D光谱，可以直接地展示出光碎片的质荷比以及对应的激光波长。由于在紫外-可见光解离实验中，母离子的强度始终高于其他光碎片离子，因此一条对应母离子强度的较明显的黄色带始终可被观察到。对于图8(a)中所示的m/z538碎片离子，其对应于母体离子在250～350及400～450 nm两个波段内的弱吸收，在550～650 nm波段内对应的强吸收也可以被反映出来。对于TCPP和TAPP，也可轻易的看出各个光碎片的贡献以及其紫外-可见光谱的不同[图8(b, c)]。

图7 三种不同质子化离子光解离碎片产率光谱

图8 质子化离子2D光解离质谱图(a)： TPP； (b)： TCPP； (c)： TAPPFig.8 2D photodissociation mass spectra of protonated(a)： TPP； (b)： TCPP； (c)： TAPP

另一方面，AutoDataMS程序还可以非常方便地实现功能的扩展，以离子相关度分析为例加以说明。相关度分析可以使研究者得知两个或多个变量之间的变化趋势。之前的一些工作中曾表明，质谱的相关度分析可提供质谱定量分析、离子化以及解离机理等方面信息[17]。以图9所示的结果为例，列出了TPP(m/z615)在500～650 nm波段内光解离后的一些主要碎片离子以及母离子的相关度分析结果。可以看出，母离子与光解离碎片离子的相关度为负，这是由于碎片离子的产生同时会伴随着母离子的消耗。

3 结论

开发了用于光解离质谱-光谱分析研究的数据自动采集与分析软件程序AutoMS。该程序基于本实验室自主搭建的研究平台设计。实验平台由一台商业FT-ICR质谱仪与两台商业OPO激光器组成，其光谱扫描范围为210～3 700 nm。通过设置诸如扫描范围、扫描步长等重要参数之后，程序可使三台商业仪器协同自动运行，无需人工干预采集光解离质谱数据。该程序同时为高分辨FT-ICR质谱及紫外-可见-红外光解离光谱提供了丰富的数据分析手段。目标离子的光解离光谱及碎片离子的产率光谱皆可通过程序获得。2D或3D光解离质谱-光谱的获取也可使谱图的分析与比较更加直观。数据采集与数据分析两个模块彼此相互独立，程序也具有较好的可移植性与扩展性。利用本程序，在210～700 nm波段内采集并分析了TPP，TCPP与TAPP三种化合物的紫外-可见光谱。全部光谱扫描实验完成的时间不超过3 h。实验结果为相关分子在光解离质谱和光谱研究方面提供了丰富的信息。三种化合物的光解离质谱由于其不同的碎片通道和对激光照射的不同响应而有所差异。结果展现出有机化合物的不同取代基对其光谱特征及光解离质谱所产生的影响。因此认为这一程序的应用可以帮助研究者高效率地采集光解离质谱及光谱数据，用于相关体系的结构及动力学研究，也可为复杂样品的分析提供有力的技术支持。