餐厨垃圾厌氧发酵产甲烷及微生物群落研究

宁祉恺，刘帅，黄元宸，刘德启 (.苏州大学材料与化学化工学部及苏州纳米科技协同创新中心，江苏 苏州 252；2. 苏州工业园区清源华衍水务有限公司，江苏 苏州 2500；.苏州大学纺织与服装工程学院，江苏 苏州 252；4.华衍环境产业发展(苏州)有限公司，江苏 苏州 252)

0 引言

随着我国社会经济的快速发展，餐厨垃圾产生量与日俱增，因其中富含碳水化合物、油脂、蛋白质及水分，又具有显著的易腐发臭特点。因此，餐厨垃圾已成为目前一种新的环境污染源并引起广泛的社会关注。其中厌氧发酵处理亦成为其资源化、无害化与减量化的主要途径。近年来，通过添加组分对厌氧反应器发酵体系C/N比及微生物群落结构的调控受到重视并成为研究的热点。研究人员以餐厨垃圾和秸秆按比例混合后为连续高温共发酵基质，开展了55 d长期试验，通过控制水力停留时间(HRT)及有机负荷(OLR)探讨反应器的运行稳定性及微生物群落组成。实验发现，当HRT降至0.5 d时，会导致反应器中微生物流失，即使pH值稳定在7.0左右，未出现VFA累积，反应器几乎停止产气，挥发性固体去除率也仅为5.77%。高通量测试结果表明，此时体系内梭菌目(Clostridiales)等能与产甲烷菌共生的水解酸化细菌的比例增加近1倍，但嗜乙酸产甲烷菌降至0.6%。显然，厌氧反应器中的微生物群落结构与环境条件紧密关联，由于不同菌群的世代更替周期存在显著差异，因此厌氧生物反应器操作条件的变化会引起微生物种群的演替，进而导致微生物群落结构的自适应性重整。

本文以从苏州某区学校、餐饮、企业、医院、快餐等集中收集的餐厨垃圾为处理对象，利用公司附属污水厂的厌氧污泥为协同发酵体，探讨厌氧污泥添加量对餐厨垃圾高温厌氧发酵产气速率、产气量及组分变化的影响；利用16S rDNA扩增子测序技术探讨反应器运行68 d后稳定产甲烷的微生物群落结构，并与接种污泥微生物群落结构为对照，识别其建群种与优势种微生物。旨在利用厌氧消化技术实现园区餐厨垃圾的资源最大化、过程清洁化的可行性，以期为该区餐厨垃圾的厌氧发酵工艺设计、运行过程风险管控与应急处置提供理论基础。

1 实验部分

1.1 实验材料、装置与实验方法

实验用餐厨垃圾样品采自公司从园区集中收集的餐厨垃圾，剔除其中杂质如塑料袋、方便筷等，用粉碎机匀浆，过10目筛子后装入自封袋放入冰箱中在-20 ℃下保存备用。接种泥为公司污水处理厂的典型厌氧污泥，收集后置于4 ℃下保存备用[1]。

实验装置主要由恒温搅拌发酵装置及集气装置构成，用橡胶管连接。实验前检测气密性，并按实验计划装入实验材料，实验运行68 d。

实验按餐厨垃圾与接种污泥的不同比例(折干基)采用5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4及0∶5 单独及协同发酵连续实验；6个反应器的固体含量均为8%，每天定时向反应器中加入7.5 g基质。协同消化实验的接种泥量均为150 mL，HRT为20 d，OLR挥发性固体(VS)为4 kg/(m3·d)。每天定时记录产气量并检测收集气体组分；定期取样监测反应器中发酵液的相关理化指标。

1.2 反应液测定指标及分析方法

总固体含量(TS)及VS测定方法参见GB/T 14415—2007及GB/T 5009.4—1985；脂质采用索氏提取法，参见GB/T 14772—2008；挥发性脂肪酸(VFAs)采用滴定法，参见Q/YZJ 10-03-02—2000；蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；COD采用重铬酸盐法，参照GB 11914—1989；C、H、N元素含量测定采用Perkin Elmer 2400II元素分析仪。

1.3 反应器气相组分及测定方法

6个反应器产生气体的组分分析，采用 POLI MP400S (mPower Electronics Inc.)及Multi RAE 2 (RAE Systems, USA)对收集瓶中气体进行组分分析[2]。

1.4 高通量测序及分析

高通量测序：将收集的待测样品送往苏州金唯智生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 测序平台进行16S rDNA扩增子测序。利用金唯智自主研发的引物体系有效扩增出16S rDNA的多个可变区，能够准确鉴定出包含古生菌在内的多个物种。

多样性分析：利用Usearch软件平台(http://drive5.com/uparse/，V7.0)，将测得的序列按照彼此间97%的相似性进行划分得到OTU；选择97%相似度OTU进行多样性指数计算，采用覆盖度(Coverage)反映微生物物种的覆盖率；采用香农(Shannon)指数等反映物种的多样性；采用Chao1指数反映群落的丰富度[3]。

2 结果与讨论

2.1 温度对餐厨垃圾单独发酵产气量的影响

先进行餐厨垃圾单独静态发酵，设置5个温度范围，分别为15、25、35、45及55 ℃，探讨园区餐厨垃圾发酵潜力及适合的发酵温度。温度为15、25、35、45、55 ℃时，反应器的平均产气速率分别为10、145、325、380及560 mL/(g·d)。显然，反应器厌氧发酵温度为55 ℃时的平均产气速率最高，因此，将55 ℃设置为后续实验的发酵温度[4]。

同时，进一步分析了55 ℃静态发酵反应器中发酵液COD与产气量随时间变化规律，结果如图1所示。图1(a)中餐厨垃圾单独发酵在实验开始时过滤液的COD为58 000 mg/L，逐渐上升到第6天时的70 000 mg/L，表明这段时间反应器中的餐厨垃圾匀浆颗粒在微生物酶催化下发生了水解，产生小分子有机酸导致反应体系 pH 值的下降。其中pH从第18天的5.7，迅速上升到第24天时的7.5，其后发酵液的pH维持在7.0～8.1之间。由此推测反应体系中嗜酸微生物种群的增加可能会加速产甲烷的速率。第36天后COD呈逐日下降趋势，第66天实验结束时COD为20 000 mg/L，去除率达到63.2%。如此同时，反应器在整个反应期间出现4个产气峰值平台，这基本对应发酵体系COD出现显著变化的时间。因此，反应物及其产物的关联性初步反映了微生物生化反应过程，相邻平台期持续的时间则可能预示维持该反应的微生物群落结构的建群时间，表明相关微生物群落中优势种的形成、更替与基因继承[5]。

此外，图1(b)中厌氧污泥单独高温发酵虽然出现了COD浓度的波动，但前6天的变化规律则与餐厨垃圾单独发酵相反，产气积累量低且随时间未出现图1(a)中餐厨发酵的4个产气平台期。表明厌氧污泥的单独高温发酵只是原微生物群落无基质高温淘汰与选择及再驯化、培养的结果，最后仅是新建微生物群落的内源呼吸与代谢。

2.2 餐厨垃圾单独高温发酵的产气组分分析

实验同时测定了餐厨垃圾单独高温(55 ℃)发酵产生气体的组分浓度(表1)，结果表明反应器第一及二产气平台期气体主组分以CO2、CH4、H2及H2S为主；第三产气平台期气体主组分以CH4、CO2、H2S及H2为主；第四产气平台期气体主组分以CH4、CO2、H2S为主，甲烷产量为最高，占50%～58%左右，H2则越来越少；整个反应过程均伴随少量组分CO、NH3(g)及NO(g)等。这些气相生成物是反应器微生物生化反应及微生物利用基质代谢的结果，因此，各阶段生成的气体主组分则如实的记录了主反应过程，以及与其相关的微生物群落结构及共生关系。第一、二产气平台期CO2及CH4气体占比最高，并处于相对较低的pH阶段，说明以产酸为主的微生物代谢餐厨垃圾中淀粉和纤维素等大分子碳水化合物生成小分子单糖、继而转化为有机酸等的主要路径，并伴随产H2的过程；这也符合发酵产氢的最优条件。

表1 园区餐厨垃圾在不同发酵阶段气相组分的平均浓度 单位：mg/m3

整个发酵过程产生的气相含氮副产物(NH3(g)及NOx(g))表明互营单胞菌的存在，因其是极端氨浓度下生物基质厌氧消化中的关键微生物，主要消耗挥发性脂肪酸产生甲烷。此外，第一阶段H2最大产生值与产氢菌密切相关，随后阶段发生的CH4与H2涨消现象预示嗜酸产甲烷菌与嗜氢产甲烷菌在相关阶段扮演角色(即产甲烷菌的优势种)的变化，但可能存在两种产甲烷菌群的共生或更替关系；最后阶段存在痕量的H2，意味二者共生的可能性更高。由此进一步推测园区餐厨垃圾单独高温发酵过程的微生物群落演替，除相关微生物群落中优势种的形成、更替与基因继承外，还包括互惠或单向利用等共生关系。

2.3 厌氧污泥协同餐厨垃圾高温发酵对发酵液COD降解及产气的影响

实验对比了厌氧污泥的添加量对餐厨垃圾协同高温发酵体系COD降解及其产气积累过程的影响，结果如图2所示。图2(a)可以发现，随着厌氧污泥的添加及其量的增加，发酵液COD最高值均比餐厨垃圾单独发酵时的最大值(70 000 mg/L)低，且添加量越多，COD最高值越小；此外，从前6天的变化趋势上看，添加量为1∶4时，趋于餐厨垃圾单独发酵规律；为2∶3时，趋于厌氧污泥单独发酵规律；当达到3∶2及4∶1时，厌氧污泥占比相对较高，由餐厨垃圾中的有机物水解所提供的有机碳仅能够满足或不能够满足此时系统微生物群落的摄食需求。因为微生物的比增长速率和限制性基质浓度具有Monod生长动力学规律，当基质充分时，细菌的增长速率与基质浓度无关；基质不充分时，细菌的增长速率则遵循一级基质代谢规律，此时有机物浓度的多少成为微生物群落生长速率的限制性因素。因此，在给定的OLR，稳定期发酵体系的微生物生长期为减速生长期，微生物群落的数量趋于最高值；否则，在外界提供的OLR不能够满足群落需求时，则发展成为内源呼吸期，微生物总量则趋于下降，如厌氧污泥占比为4∶1的协同发酵系统。

不同比例下的产气积累量也进一步支持了上述的观点，如图2(b)所示。从图中可以看出，随着厌氧污泥的添加及其量的增加，协同发酵体系的产气积累量最大值介于厌氧污泥与餐厨垃圾单独高温发酵产气积累量之间；其中厌氧污泥添加比例为1∶4时及2∶3时，产气总量分别为17 540 mL及17 440 mL，为协同发酵体系的相对最高值。因此，结合运行处理能力及处理效率，将协同发酵体系的厌氧污泥添加比例控制在1∶4～2∶3最为合适；不仅能够获得最佳的产气效率，而且在此比例下微生物群落处于对数生长期，对餐厨垃圾中的有机物代谢速率也达到最高，这一点可以从图2(c)中发酵体系COD的降解率上得到充分的说明。

图2 厌氧污泥协同餐厨垃圾高温发酵对发酵液COD降解及产气的影响

此外，当协同发酵体系的厌氧污泥添加比例控制在0至2∶3时，均会出现4个较为明显的产气峰值平台期；并且随着厌氧污泥添加量增加，产甲烷稳定期到来的时间逐渐缩短。这些结果也进一步表明采用高温协同厌氧发酵处理园区餐厨垃圾时，厌氧污泥作为种菌污泥参与餐厨垃圾高温发酵处理具有可行性，不仅具有较好的处理效果，而且还具有较高的环境与经济效益。同时，一旦因各种因素导致协同发酵系统运行失控，处理效率及产气量的大幅度下降，则可按照厌氧污泥比例从4∶1、逐步过渡到3∶2的添加量，可使失衡的发酵系统在20 d内迅速恢复到稳定的产甲烷平衡阶段，与餐厨垃圾单独高温发酵的恢复期相比，可缩短30 d以上。

2.4 厌氧污泥协同餐厨垃圾高温发酵稳定期的微生物多样性分析

厌氧污泥及协同发酵稳定期生物样品经高通量测序的结果如表2所示。2份样品测序分别获得17 631 000及15 500 000 Bases(bp)，过滤后的有效序列平均长度分别为456.48 bp及452.27 bp,Reads分别为70 524 及62 000。2样品测得的OUT数分别为1 640个及1 109个，前者OTU平均数目比后者OUT数多531个。厌氧污泥样品的Coverage值为99.6%，协同发酵稳定期生物样品的达到100%，说明测序结果如实表达了样品所代表的微生物群落的客观现状。

表2 厌氧污泥及协同稳定发酵期生物多样性分析

其中，厌氧污泥的Shannon值及Simpson值分别为8.614及0.992, Chao1值为1 649.563；分别高于协同发酵稳定期生物样品的相关值(6.702、0.962及1 109.143)。通常，生物多样性指数Shannon值越大说明群落的多样性越高，Chao1值越大说明群落的丰富度越高；因此，厌氧污泥样品的微生物多样性和丰富度相对更高，这意味着发酵的高温淘汰了厌氧污泥微生物群落中的不适种，选择了协同发酵体系中的耐高温种群。

2份生物样本在不同分类水平下的物种种类数目如表3所示。从表中可以看出，协同发酵稳定期污泥生物样本在门、纲、目及科水平上的物种数量分别仅为菌种样本的物种数的69.7%、52.2%、34.6%及39.6%。这进一步说明反应器的发酵环境条件，尤其是高温的胁迫效应，驱动了协同发酵种群污泥中的微生物群落的分化、选择与适应[6]。

表3 2份生物样本在不同分类水平下的物种种类数目对比

同时，用R语言统计了2份生物样本的种水平(Species)微生物种类数，结果表明厌氧污泥及协同稳定发酵期污泥样品中的微生物种类分别为1 558种及1 027种，其中的共有种类仅为82种，分别占其各自物种数量的5.3%及8.0%。这一结果充分的说明了经过前3个产气累积峰值平台期的高温、高OLR、低pH、有毒代谢副产物环境因子的选择压力，在第4个产气累积峰值平台期到来时仅继承保留了厌氧污泥中的5.3%的微生物种类，新建微生物种类为945种，占比高达94.7%[7]。

对上述2份生物样本中上千种微生物物种，按照Top 30的物种，用R语言统计并作不同物种的相对丰度图(图3)。其中，拟杆菌门(Bacteroidetes)是2份生物样品中均具有的最丰富的微生物，分别大约占28%及31%，是微生物群落的关键建群物种；同时此类微生物在餐厨垃圾协同高温发酵过程中得到延续与发展。但厌氧污泥中的变形菌门(Proteobacteria)及酸杆菌门(Acidobacteria)的大多数微生物在其协同高温发酵过程中遭到淘汰，随后被厚壁菌门(Firmicutes)及热袍菌门(Thermotogae)的微生物所替代。因为Firmicutes门及Thermotogae门具备适生的生物结构及生理特性资本，并能在高温、高OLR等胁迫因子的环境条件下对餐厨垃圾降解起主要生化作用，参与对多种复杂有机质(如：淀粉、蛋白质及油脂等)的降解，为人类餐厨垃圾资源化及无害化处置作贡献[8]。

图3 2份生物样品在门水平上的主要微生物种群及其相对丰度

3 结语

本文系统的开展了厌氧污泥协同餐厨垃圾高温厌氧发酵的资源化实验研究。通过对反应器产量采集、发酵液理化指标及生物样品的高通量测序分析，以厌氧污泥及餐厨垃圾单独高温发酵为对照，探讨了厌氧污泥协同餐厨垃圾高温厌氧长达66天发酵过程的产气累积量与气相组分、COD降解随时间的变化规律，发现在停留时间、有机负荷率完全一致的情况下，餐厨垃圾的占比与甲烷产生效率、产量之间为正相关的关系；餐厨垃圾在混合基质中所占的比例对于有机降解率具有决定性作用，占比越大，有机降解率就越高。另外对接种污泥及发酵后的混合污泥进行了高通量测序检验，发现了餐厨垃圾协同高温发酵系统的微生物群落的主要建群微生物拟杆菌门(Bacteroidetes)及种群演替规律。研究结果可为属地餐厨垃圾资源化利用及无害化处理工艺设计、处理系统稳定、高效运行及风险管理与应急处置提供科学依据。