HIV抗体酶联免疫试剂性能验证

魏小文，付继红，欧阳良，屈海琴，周爱华，樊华奔，皮丽，吴兰，方丽娟

（江西迪安华星医学检验实验室有限公司，江西 南昌 330000 ）

0 引言

获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病，是由于人类免疫缺陷病毒感染以后所引起的传染病。人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体的血清学筛查试验方法常用的有ELISA、CLIA、免疫渗虑层析试验等。人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体的实验室检测是诊断艾滋病的重要依据，一般使用酶联免疫吸附试验（ELISA）作为筛查方法[8]，由于该疾病的特殊性，如何保证患者能有效检出，主要取决于诊断试剂的性能，所以对HIV酶联免疫吸附法试剂盒性能情况进行确认。

1 一般资料

依据CNAS-CL02-A004《医学实验室质量和能力认可准则在临床免疫学定性领域的应用说明》的要求，对试剂盒的符合率（采用国家标准血清盘），精密度（包括重复性和中间精密度）、检出限（采用康彻斯坦的质控品）进行性能验证试验[2]

1.1 材料与方法

1.1.1 仪器

安图酶标仪PHOMO、华科瑞HW209696孔洗板机、生物安全柜BSC-1100ⅡA2-X，以上仪器均由广州广电计量检测股份有限公司进行校准。

1.1.2 试剂

北京万泰人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（批号：I20191234）。

1.1.3 质控品

1.1.3.1 室内质控品(浓度: 0.5NCU/mL，北京康彻思坦生物有限公司，批号201912005) ；

1.1.3.2 HIV抗体血清参考盘（批号：201901001，有效期至20210123），HIV抗体血清参考盘阴性10份，阳性10份，共20份。

1.2 方法及判断标准

1.2.1 阴阳符合率HIV抗体血清参考盘阴性10份，阳性10份，共20份样本，随机每4份成一组[1]按下式计算：阴性符合率%=（验证方法与血清盘一致的阴性结果÷10）×100%。阳性符合率%=（验证方法与血清盘一致的阳性结果÷10）×100%。待评价方法与血清盘的阴性符合率及阳性符合率均应≥95%，验证通过。

1.2.2 精密度试验

1.2.2.1 重复性精密度所选样本至少有一个在临界值附近，采用接近临界原倍质控稀释3.5倍作为水平一、原倍质控作为水平二两个浓度水平，两水平各重复检测20次，验证批内重复性，计算S/CO的均值、标准差和变异系数（CV）。要求批内CV<10%，则验证通过[4-5]。

1.2.2.2 中间性精密度所选样本至少有一个在临界值附近，采用接近临界原倍质控稀释3.5倍作为水平一、原倍质控作为水平二两个浓度水平，每天检测1个批次，2个浓度，每个浓度重复测定2次，连续10天(第1天两水平重复检测20次，验证批内重复性)，计算S/CO的均值、标准差和变异系数（CV）。要求批间CV<15%，则验证通过[4-5]。

1.3 检出限

将选择的康彻思坦标准物质0.5NCU/mL稀释到略高于临界值浓度（其S/CO值在cutoff值附近），每个稀释度每天重复测定4次，连续测定5天，以19次以上结果为阳性，其浓度为检出限，也即C95浓度。判定标准：LOD（检出限）=已知原倍阳性质控浓度/稀释倍数。

2 结果

2.1 阴阳符合率用试剂盒检测HIV抗体血清参考盘的阴性和阳性样本，样品的检测结果阴阳符合率均为100%，具有可比性。（表1）

表1 北京万泰酶联免疫试剂HIV阴阳性符合率（HIV抗体血清参考盘201901001）

2.2 精密度验证

2.2.1 重复性精密度

检测浓度为0.5NCU/mL稀释3.5倍质控和原倍质控的CV%分别为3.97%和3.65%小于厂家试剂盒说明书给的参考值（≤10%），验证通过。（表2）

表2 北京万泰HIV试剂盒批内重复性精密度验证结果

2.2.2 中间性精密度

检测浓度为0.5NCU/mL稀释3.5倍质控和原倍质控的CV%为 9.05%和7.21%；CV%小于厂家试剂盒说明书声明的 15%，验证通过。（表3）

表3 北京万泰HIV试剂盒批间中间精密度验证结果

2.3 检出限

用生理盐水将康彻思坦标准物质0.5NCU/mL稀释为6.5、7、7.25、7.5倍，每个稀释度每天重复测定4次，连续测定5天，以19次以上结果为阳性，计算每个浓度标本检测所得S/CO的均值，检出限，标准品稀释7倍时的浓度为检出限，其值为0.07NCU/mL，对应的S/CO均值为1.12。（表4）

表4 北京万泰酶联免疫试剂HIV试剂盒检出限验证

3 讨论

酶联免疫吸附试验（ELISA）是HIV主要的筛查方法，试剂盒质量是直接影响实验结果的主要因素，为尽可能避免漏检和假阳性结果，在选择使用试剂之前应该对其性能指标进行验证评估，从而确定性价比高，质量稳定的试剂。

我们参考CNAS-GL038：2019《免疫定性检验程序性能验证指南》，结合本实验室实际情况，制定了人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体ELISA定性检验方法和程序分析性能验证方案。

本实验室对选用的北京万泰HIV酶联免疫试剂盒进行阴阳符合率、精密度（重复性和中间精密度）、检出限进行了验证。检测试剂盒的阴阳符合率是评估试剂盒性能和质量的重要指标[6-7]，本实验室的阴阳符合率是通过对HIV抗体血清参考盘检测来验证，阴阳符合率均为100%，验证通过，保障结果的安全性和准确性。

《WST505-2017定性测定性能评价指南》中指出“评价定性检测试剂或系统精密度时，应采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度”[3]本实验室重复性精密度检测CV%分别为 3.97%和3.65%；中间精密度试验的 CV%为 9.05%和7.21%，均验证通过。说明试剂盒的稳定性和重复性均较好。

最低检测限是可检测出的最低分析物的浓度，所以在试剂正式应用于检测患者样本前，确定试剂盒的检出限是尤为重要的。从检测结果中可以看到，本实验室所使用的北京万泰HIV酶联免疫试剂盒的检出限为 0.07NCU/mL。能有效避免假阴性和假阳性。

为了使性能验证试验结果可靠，本实验室在实验前做了准备很充分：

（1）对实验室设施及环境进行规划和整改，达到符合生物学实验室的技术要求；

（2）试验所用的仪器均经过校准，各项性能指标合格试验要求；

（3）承担性能验证的操作人员经过岗前培训，熟悉性能验证方案及仪器性能，质量控制，操作熟练、规范，并且指定专人操作；

（4）对试验过程中的质量控制控制点进行监控，密切注意操作人员的加样量、试剂使用、水浴箱中水温及水位、孵育时间、洗板效果以及实验室温湿度的变化等；

（5）性能验证过程使用同一批号的试剂盒，且使用质控品进行室内质控控制；

（6）试剂盒、质控品室温避光充分复温、复融。

（7）试验后的数据分析，统计及得出合理结论等。

综上所述，通过对北京万泰HIV酶联免疫试剂盒阴阳符合率、精密度（包括重复性和中间精密度）、检出限验证表明，该试剂能够满足本实验室的质量目标，可用于本实验室HIV抗体初筛检测。