培养基组分对蓝莓组培芽的诱导及增殖效率的比较研究

杨 俐 赵素萍

（云南省大理市植保植检站,云南 大理 671000）

蓝莓(Blueberry)又名越橘，杜鹃花科(Ericaceae)越橘属（Vaccinium）植物，为多年生落叶或常绿灌木类果树。蓝莓野生种在我国广泛分布，常见于海拔400-1400m的山林或灌木丛中，是酸性红埌土的指示植物。大理周围山林地也有分布，但品质与引进的栽培品种相比较差，无市场价值。蓝莓果实中含有丰富的鞣花酸和花青素类物质，以及具有低糖，低脂肪和强抗氧化能力等特点，是联合国粮农组织重点推荐的人类五大健康食品之一，被誉为世界水果之王。是最近几年世界发展最为迅速的集营养保健于一身的第三代果树新品种。目前植物组织培养以及扦插技术广泛应用于蓝莓的繁殖栽培。近三十多年来世界各国在蓝莓组织培养的技术上已有深入的进展。我国刘庆忠等在蓝莓组织培养工作中最早开展研究工作，取得了很好的成绩。吉林农业大学于1983年率先在我国开展了蓝莓引种栽培工作，另外山东果树所，南京农科院，大连理工大学先后从国外引进二百多个品种，同时开展了蓝莓繁育技术的研究。目前组织培养快速繁殖技术已成为各地蓝莓苗繁育的主要途径，各地使用的培养基配方也很多，技术效果各不相同。我们采用了目前我国通用的WPM改良配方，同时自己也设计了WM配方，并对两者进行了比较研究。

1.材料和方法

1.1 外植体

试验用蓝莓品种由大理市蓝莓种植合作社提供。分为休眠枝与萌发枝两种类型。休眠枝来自2012年冬季11.12月及2013年2月。萌发枝来自2013年3-8月。以高灌品种密斯提(Misty)(薄雾)为主，夏普蓝(Sharpblue)及兔眼品种灿烂(Bright well)为辅为对比。在田间选取一年生健壮枝条带回实验室。切除叶片和顶部花芽，留取下部约10个腋芽的茎段作为外植体。在流水下洗去灰尘后浸泡在含有洗衣粉的水中清洗二次，然后流水冲洗1h。控干水分后置超净工作台中，先用较干的75%酒精棉球擦去表面水分，用无菌剪刀剪成5cm段置无菌烧杯内，加入75%酒精浸1min，无菌水冲洗一次，加入0.1%升汞10mim，水洗5次，切成0.5-1cm小茎段，每段带1个腋芽接种。用50ml三角瓶，每瓶接1个茎段，也有用培养瓶接3个茎段。25℃±2℃2000lx16h/d。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及激素配比

本实验所用培养基有二种。一是通用的WPM改良培养基，另一种是自己设计的WM培养基。分别称为A(WPM)及B(WM)培养基。休眠芽初代分化培养激素配比设六个组合，A、B两种培养基相同。继代增殖培养设三种组合，A、B相同。萌发枝初代分化培养只用B培养基，设六个组合。继代增殖培养也只用B培养基设四个组合。壮苗培养基为B+ZT0.1+IBA0.1mg/L；在生根培养前也可经由B+ZT0.5+IBA0.1mg/L继代苗转入。生根培养为三个组合。

1.2.2 休眠芽的初始分化培养

表1 同一培养基不同激素配比对幼苗分化的比较，品种：薄雾(misty)，培养天数50天。

B2.3 0 2 0 0.1 30 13 43.3有愈伤组织

由表一可以看出，休眠芽萌发率普遍不高。最高者为43%（B2.3），最低着26.6%（A1.2、A1.3、B1.2）。在各激素对比中，ZT2mg/L萌发率最高43.3%及40%，ZT1+BA1mg/L和ZT1mg/L，次之(36.6%和33.3%)，而BA较低(33.3%，30%及26.6%)。但是萌发率最高的ZT2mg/L有少量愈伤组织产生，多在茎段基部。如果以叶片为外植体，在叶片切口处及叶柄断口处产生许多绿色愈伤组织。就A与B两培养基相比，B培养基的幼苗叶色较绿，叶片也较宽。

表二 不同品种之间在初始培养中分化率的比较，培养天数50天品种：夏普蓝(Sha rpblue)、薄雾(misty)及兔眼(Brightwell)

以上三个品种通过比较,以2号品种薄雾的萌发率较高，夏普蓝居中，灿烂较低。

1.2.3 休眠芽幼芽的继代增殖培养

表三 薄雾在不同激素配比的继代培养中增值效果的比较，培养天数50天

通过二种激素含量对比，50天培养后，平均增殖幼苗数分别为5.5个和6.1个。苗高度最高7.2cm，平均4.5cm与4.3cm。增殖率5倍以上。但ZT2mg/L的幼苗叶片较小，叶色发红，可能是与非极性物质及色素大分子的积累有关。ZT2mg/L在茎段基部有时会有少量愈伤组织产生。通过降低ZT含量(下降至0.1mg/L)并加入1g/L活性炭可使其恢复正常生长。

1.2.4 萌发枝的初始分化培养

经过第一阶段对休眠枝初始分化及继代培养的观察比较，在萌发枝的组织培养中选用薄雾品种为研究对象，进一步的比较观察，为今后大批量生产提供参考依据。

表四 相同培养基（A及B）中，不同激素对初始分化效果的比较，品种：薄雾、培养天数30天

通过上表可以看出，萌发枝经过培养后，幼芽萌发率比休眠芽明显提高，最高可达80%分，最低也达56.6%，B2.3的ZT含量2mg/L，虽然萌发率高(80%)，但有些茎段基部会产生愈伤组织，而B2.2萌发率仅次于B2.3，基本不产生愈伤组织，而ZT用量减少了一半(ZT1mg/L)。经过对A及B两种培养基的生长情况比较，B培养基叶较宽大，叶色也较绿，为下步继代培养提供了参考。

1.2.5 萌发枝的继代增殖培养

表五 B培养基，不同激素配比对薄雾增殖效果的比较，培养天数50天

通过以上激素对比，可以看到B2.2效果最好，幼苗分枝数、高度、叶色均较好，而TDZ组合，以TDZ0.02mg/L较合适，TDZ0.05mg/L幼苗基部生长较多愈伤组织，苗也不高，分枝也较少。

值得注意的是本次实验结果的增殖率不高。原因是在5月底、6-7月大理天气炎热，培养室无制冷空调，室温常达28℃以上，最高31℃，使幼苗生长受到抑制，叶色开始变淡，甚至发黄。8月下旬起，气温逐渐下降，生长有所恢复，至9月后室温在27℃以下，生长才转入正常。整体看，与其他作物相比，增殖率不高，苗也不高，效果不理想。

1.2.6 生根培养

对休眠枝和萌发枝的继代幼苗进行了生根培养，幼苗来自不同细胞分裂素含量，其生根效果不同。

表六 由继代培养转入生根培养时不同细胞分裂素含量对生根效果的比较，品种：薄雾、培养时间50天生根培养基：1/2 B+IBA0.6mg/L+活性炭1g/L

由上表可以看出，从继代培养转入生根培养时，必须减少细胞分裂素的含量，否则不生根，只有茎的基部略膨大，有少量根原基产生。如通过壮苗培养，生根效果较好，在壮苗培养基中ZT为0.1mg/L含量很低，苗生长慢，比ZT0.5mg/L要差些，但生根效果比ZT0.5mg/L要好。

在生根培养基筛选方面，做了三个组合，结果如下：

表七 不同生长素含量对薄雾生根率的比较，培养时间50天

通过生长素含量对比，以IBA0.6mg/L较为合适。IBA浓度为1mg/L时，根少而粗短，含量低，则根纤细而多。

1.2.7 瓶外生根

材料选自经过壮苗培养或生根培养未生根的幼苗。将幼苗取出，在水中(加入800倍多菌灵)洗去培养基，在生根液中浸蘸。使用两种浓度，一种是NAA1000mg+IBA1000mg/L，这种浓度采用速蘸一下；另一种IBA100mg/L浸泡30min。所用基质为消毒后的水苔经800倍多菌灵浸泡12h，然后挤干水分后平铺在塑料筐内，厚7cm。将小苗用镊子扦插在苔藓苗床上。扦插后外边罩上一层塑料农膜保湿。7天内保湿度95%，20-28℃，放在培养室背光处(防阳光直射)；第二周保湿度85%；20天后逐渐揭去薄膜增加透气。生根后每周喷1/2大量元素与0.1%Feso4交换喷施，逐渐改成0.2%硫酸铵及0.2%Feso4二周浇施一次。90天后可移栽至直径15cm的营养钵内，基质为草炭土+松针腐叶土+沙壤红土(1:1:1)。

2.讨论

2.1 蓝莓休眠芽的初代培养与萌动芽相比，萌发率偏低。如通过一段室内水培过程，可以提高芽的萌发率。具体做法是将休眠枝条按常规清洗好后，浸入稀新洁尔灭液中15min，蒸馏水洗二次。然后插入蒸馏水中深约3-5cm。在培养室全光照，25℃，每天换水，使休眠芽萌动后再消毒接种。

2.2 蓝莓培养过程中，污染现象严重，初次消毒曾增加生汞含量为0.15%，消毒10min，或升汞0.1%增加消毒时间为15min。这两种方法对芽的伤害较大，影响发芽率。另一方面，在培养30天以后，有不少培养瓶内茎段基部出现细菌性污染，真菌性较少。这些细菌是否为茎内已存在的内生菌，也不清楚。我们在培养基中加入青霉素，结晶紫，效果不明显。

2.3 在培养过程中，幼苗叶片产生红或紫红色，或叶色变淡，发黄，发白，甚至玻璃化等现象。这些情况多发生在培养室内温度超过28℃，瓶盖为塑料盖，瓶内透气不良，出现水渍状，光照不足等。经过室内温度调整，改用透气膜瓶盖，对培养基组分含量进行调整，保证16h/d光照，加入0.5-1g/L活性炭等措施，这些情况有所改善。

2.4 在蓝莓初代分化培养及继代培养中，均使用不同含量和种类的细胞分裂素，进行比较。我们认为ZT效果比BA略好一些，但ZT价格昂贵，使用量也大，而BA价格低廉，且耐高压消毒，幼苗的质量也好，所以用BA代替ZT完全可以完成初代分化及继代增殖的培养，可以大大降低成本。我们也使用了TDZ代替ZT，使用浓度为0.02mg/L，是ZT含量的50-100分之一。虽然TDZ价格贵，但因使用浓度极低，其成本价与BA相近。而且培养的幼苗生长状况也较好。所以TDZ也是代替ZT的理想细胞分裂素。

2.5 作者自己设计了WM培养基，在蓝莓的初代，继代培养中表现出幼苗叶片比WPM改良培养基略宽大，叶色也较绿，效果胜似WPM。