TLK2促进人乳腺癌细胞系增殖、迁移和侵袭

熊玉圆，陈德杰，孟 琳，晏 珊

(湖北文理学院附属医院 襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441021)

乳腺癌(breast cancer)是发生于乳腺导管上皮的恶性肿瘤[1]。全球每年约208万例新诊断病例，有62.6多万例死亡病例[2]。Tousled样激酶2(tousled like kinase 2,TLK2)是丝氨酸-苏氨酸激酶家族成员之一，与各种生物体中的DNA复制、DNA修复、转录和染色质结构等有关[3]。TLK在人类恶性肿瘤进展中频繁扩增，成为癌治疗的潜在靶标[4]。例如，TLK2被鉴定为治疗结直肠癌和胶质母细胞瘤的潜在生物标志物[3,5]。已有报道TLK2与乳腺癌风险增加相关联[6]。Targetscan在线分析数据库提示，TLK2和miR-622之间存在潜在的结合位点。本研究旨在探索TLK2在乳腺癌中的表达、TLK2对乳腺癌细胞恶性表型的影响及其相关机制。本研究初步证实了miR-622/TLK2轴参与调控HCC70细胞增殖、迁移和侵袭，为乳腺癌的诊断和治疗提供了新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料：从接受肿瘤切除术的患者中收集52例乳腺癌患者的病理组织标本及邻近组织，立即存储在-80 ℃冰箱中。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。本研究获得所有患者知情同意和襄阳市中心医院研究伦理委员会批准(XY20180501009)。

1.1.2 细胞与试剂：人正常乳腺上皮细胞系(MCF-10A细胞)和乳腺癌细胞系(HCC70、MCF-7细胞)(中国科学院上海细胞生物学研究所)；miR-control、miR-622抑制剂、空载质粒、过表达TLK2质粒(上海吉玛制药技术有限公司)；RPMI1640培养基、牛血清和青霉素/链霉素(上海碧云天生物技术有限公司)；LipofectamineTM3000、Trizol试剂(Invitrogen公司)；PrimeScript RT Master Mix Kit(TaKaRa Bio公司)；引物序列(Genecopoeia 公司)；CCK-8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；BrdU抗体、抗TLK2(Abcam公司)；辣根过氧化酶标记的二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；Transwell小室、脱脂牛奶、PVDF膜(Millipore公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养和分组处理：将MCF-10A细胞和MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱培养，每2～3 d更换培养液。待细胞接近80%汇合时用0.25%胰蛋白酶消化传代。将细胞接种于12孔板，每孔细胞为1×106个，分为3组：对照组细胞正常培养，过表达TLK2组及转染miR-622抑制剂组。

1.2.2 免疫组织化学法检测组织中TLK2的表达:临床标本在10%甲醛中固定、包埋、脱蜡和水化。用1% H2O2阻断内源性过氧化物5 min,PBS洗3次，免疫染色封闭液封闭1 h，之后用羊抗兔抗体(1∶200)孵育4 ℃过夜。PBS洗涤切片，然后用生物素标记的抗血清室温下孵育1 h。再次洗涤切片，DAB着色1 min，苏木精染色1 min，在显微镜下观察。

1.2.3 RT-qPCR检测TLK2 mRNA和miR-622的表达：利用Trizol试剂提取总RNA，然后使用转录试剂盒反转录为cDNA。采用SYBRGreen法，以cDNA为模板，利用miR-622和TLK2特异性引物进行PCR扩增。对每组样品进行一式3份定量PCR检测。使用2-ΔΔCt方法计算miR-622和TLK2 mRNA相对表达量。PCR进行的条件如下：95 ℃预变性5 min，然后在95 ℃下变性15 s，在60 ℃下退火30 s。引物序列如下：TLK2：5′-ACTAGCGCAAAGG AACTCAATGTG-3′ (上游引物)，5′-CCAGACCAG GCAAGACTCAGAC-3′ (下游引物)；miR-622:5′-ATCCCAGGGAGACAGAGATCGAGG-3′(上游引物),5′-AA GCTTGGTGGTGGACTTTTGGTTGT-3′ (下游引物)；GAPDH：5′-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′ (上游引物),5′-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3′ (下游引物);U6:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(上游引物),5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(下游引物)。

1.2.4 Western blot检测细胞中TLK2的表达：用RIPA提取MCF-10A、HCC70、MCF-7细胞中总蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，采用SDS-PAGE分离总蛋白后转至 PVDF 膜上。将膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000)过夜。次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，ECL显影。

1.2.5 CCK-8法检测HCC70细胞增殖：按照约2×103个细胞/孔接种于96孔板，培养1、2、3、4和5 d后取出，加入10 μL/孔CCK-8试剂后继续孵育2 h。于酶标仪450 nm波长下检测每孔吸光度值。

1.2.6 BrdU掺入实验：将HCC70细胞(2×103个/mL)接种于24孔板中。当细胞汇合至80%时加入10 μmol/L BrdU。将细胞DNA经变性处理后加BrdU一抗(1∶300)，常温孵育2 h。加入荧光二抗常温孵育2 h，用DAPI复染细胞核后，在荧光显微镜下进行观察。随机选择10个非重叠视野。计算BrdU阳性细胞数，取其平均值。

1.2.7 Transwell小室法评估HCC70细胞迁移和侵袭的能力：在侵袭实验中，将Matrigel基质胶加入Transwell小室中。在Transwell小室上室加入含胎牛血清的培养基，下室加入含有胎牛血清的RPMI1640培养基。37 ℃继续培养24 h后，甲醇固定下室中的细胞并用0.1%结晶紫染色，在倒置显微镜下拍照，显微镜下观察穿膜细胞数，计数中间及四周5个高倍镜下视野细胞数，计算平均数。迁移实验，除在Transwell小室内未加入Matrigel外，其他步骤与侵袭实验相同。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验：将含有野生型及突变型TLK2的片段分别整合入pGL3 vector。将上述片段分别与miR-622模拟物或阴性对照物共转染HCC70细胞。转染48 h后，按照制造商的说明测定荧光素酶活性。所有实验一式3份，重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TLK2在乳腺癌组织和细胞中高表达

乳腺癌组织和癌旁组织免疫组化染色代表图(图1A)。癌旁组织中有31例阴性表达，21例阳性表达。乳腺癌组织中有19例阴性表达，33例阳性表达。统计结果提示TLK2在肿瘤组织中阳性率显著增加(图1B)(P<0.05)。GEPIA数据库提示TLK2在乳腺癌中高表达(图1C)。其次，与邻近的非肿瘤组织相比，乳腺癌组织中TLK2 mRNA的表达显著上调(图1D)(P<0.001)。另外，与MCF-10A细胞相比，两种乳腺癌细胞中TLK2在mRNA和蛋白水平也显著上调(图 1E，F)(P<0.05)。

A.immunohistochemical was used to detect the expression of TLK2 in breast cancer tissues and adjacent tissues (n=52);B.positive cases and negative cases of TLK2 expression in breast cancer tissues and adjacent tissues were counted;C.expression of TLK2 in breast cancer tissues and normal tissues was analyzed by GEPIA database;D,E.expression of TLK2 in breast cancer tissues (n=52)and cell lines (n=3)was detected by RT-qPCR;F.expression of TLK2 protein in the cell line was detected by Western blot (n=3);*P<0.01,**P<0.001 compared with control图1 TLK2在乳腺癌组织和细胞中高表达Fig 1 TLK2 was highly expressed in breast cancer tissues and cells n=3)

2.2 TLK2促进HCC70细胞增殖、迁移和侵袭

随后成功构建过表达TLK2细胞模型(图2A)(P<0.001)。与对照组相比，过表达TLK2显著促进HCC70细胞增殖(图2B，C)(P<0.05)和迁移及侵袭(图2D，E)(P<0.01)。

A.overexpressing TLK2 plasmid was successfully transfected into HCC70 cells;B,C.cell viability was detected by CCK-8 and BrdU assay(×100);D,E.migration and invasion were detected by Transwell assay(×200);*P<0.05,**P<0.01；***P<0.001 compared with control图2 TLK2促进HCC70细胞增殖、迁移和侵袭Fig 2 TLK2 promotes the proliferation,migration and invasion of HCC70 cells

2.3 miR-622在乳腺癌组织和细胞系中低表达

与癌旁组织相比，miR-622在乳腺癌组织中的表达水平下调(图3A)(P<0.001)。此外与MCF-10A细胞相比，miR-622在乳腺癌细胞系中的表达水平显著降低(图3B)(P<0.05)。

A.expression level of miR-622 in breast cancer tissue was detected by RT-qPCR (n=52);B.expression of miR-622 in normal human breast epithelial cell lines and human breast cancer cell lines were detected by RT-qPCR(n=3);*P<0.05,**P<0.001 compared with control图3 miR-622在乳腺癌组织和细胞中低表达Fig 3 Expression level of miR-622 in breast cancer was significantly reduced

2.4 抑制miR-622的表达显著促进HCC70细胞增殖、迁移和侵袭

进一步将miR-con和miR-622抑制剂分别转染HCC70细胞(图4A)(P<0.001)。抑制miR-622的表达能显著促进HCC70细胞增殖、迁移和侵袭(图 4B～E)(P<0.05)。

A.miR-622 inhibitors were successfully transfected into HCC70 cells (n=3);B,C.cell proliferation was detected by CCK-8 and BrdU experiments(×100);D,E.migration and invasion were detected by Transwell experiments(×200);*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control图4 miR-622抑制剂促进HCC70细胞增殖、迁移和侵袭Fig 4 miR-622 inhibitors promote HCC70 cell proliferation,migration and invasion

2.5 miR-622是TLK2的上游靶标

Targetscan分析表明miR-622和TLK2之间的结合位点(图5A)。进一步，miR-622抑制剂能够显著促进TLK2在蛋白和mRNA水平的表达(图5B,C)。进一一步，miR-622能够显著降低野生型TLK2的荧光素酶活性，但不能显著降低突变型TLK2的荧光素酶活性(图 5D)。此外，miR-622负向调控TLK2的表达水平(图 5E)。

A.binding site between miR-622 and TLK2 was predicted by TargetScan;B,C.after breast cancer cells were transfected with miR-622 inhibitors,the expression level of TLK2 was detected by Western blot and RT-qPCR (n=3);D.interaction between miR-622 and TLK2 was verified by luciferase reporter gene (n=3);E.correlation between miR-622 and TLK2 expression level was analyzed by Pearson (n=52);*P<0.05,**P<0.001 compared with control图5 miR-622靶向调控TLK2Fig 5 miR-622 targets and regulates TLK2

3 讨论

TLK2不仅是许多生物体内维持基因组稳定和正常发育所必需的，而且与肿瘤的发生紧密相关[7]。例如，TLK2沉默导致细胞周期停滞在G2/M期，最终诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡[3]。此外，TLK2通过激活下游的SRC从而促进胶质母细胞瘤细胞的恶性表型和上皮间质转化[3]。TLK2沉默通过下调ERα、BCL2和SKP2，从而抑制乳腺癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡[6]。TLK2的扩增和过度表达干扰Chk1/2诱导的DNA损伤检查点信号，导致细胞周期G2/M检查点异常，DNA修复过程延迟，染色体稳定性变差,从而诱导肿瘤的发生[8]。本研究中，TLK2在乳腺癌组织和细胞系中高表达，从而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

miRNA是短链非编码RNA，在恶性肿瘤进展中起着至关重要的作用，它通过与靶基因特异性结合在转录后水平调节肿瘤相关基因的表达[9]。已有报道指出miR-622参与抑制多种肿瘤进展。例如，miR-622的下调与神经胶质瘤的病理分级增高和总体生存率低有关。miR-622的过表达显著抑制神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，同时在体外抑制ZEB2的表达从而促进细胞凋亡[9]。miR-622通过靶向CCL18抑制肾癌细胞的增殖和转移[10]。miR-622通过靶向ING1、HIF-1α、MAP4K4、YAP1和RB1充当肿瘤的抑制因子，然而miR-622直接靶向DYRK2在结直肠癌中充当原癌基因[11]。这些研究表明miR-622产生的效应和肿瘤特异性有关。miR-622通过直接靶向RNF8 3′-UTR抑制RNF8表达，miR-622与乳腺癌之间存在潜在的相关性[12]。本研究结果表明，与对照组相比，转染miR-622抑制剂后显著促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，这提示miR-622在乳腺癌中发挥抑癌作用。通过生物信息学分析发现miR-622与TLK2之间存在结合位点。本研究发现与对照组相比，miR-622抑制剂显著促进了TLK2在蛋白和mRNA水平的表达。进一步双荧光素酶基因报告实验结果提示miR-622可以结合TLK2的3′UTR。上述结果表明，miR-622/TLK2轴参与乳腺癌的进展。

总之，本研究发现TLK2作为促癌因子在乳腺癌组织及细胞中高表达。TLK2促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，miR-622是负向调控TLK2表达的上游分子。TLK2可能成为治疗BC的新生物标志物。