Wnt-5a/JNK信号通路参与PM2.5诱导的人支气管上皮细胞系16HBE分泌IL-6和TNF-α

邹威凤，王晓茜，盛 青，祝 涛，周晓婷

(广州市胸科医院 呼吸科,广东 广州 510095)

随着大气污染的日益严重和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPDs)(简称慢阻肺)患病率的上升，直径≤2.5 μm的细颗粒物(fine particulate matter≤2.5 μm in diameter，PM2.5)在慢阻肺发病中的作用日益受到关注，但其机制尚不明了。研究显示 PM2.5 可致气道上皮细胞损伤，随后诱导一系列炎性因子和生长因子等的分泌导致气道慢性炎性反应持续存在[1]。炎性反应贯穿慢阻肺发展的整个过程，是慢阻肺气流受限的重要机制[2]。既往研究表明慢阻肺患者诱导痰中无翼型整合位点家族成员5a(Wnt-5a)表达上调且与气道阻塞程度成正相关[3]。PM2.5 可能通过诱导Wnt-5a的分泌促进慢阻肺大鼠气道炎性反应,并促进气道上皮细胞分泌炎性介质[4]。上述研究提示Wnt-5a在PM2.5相关慢阻肺的气道炎性反应中扮演了重要角色。前期研究显示PM2.5可诱导支气管上皮细胞中Wnt-5a的表达。研究提示Wnt-5a/c-Jun N 端激酶通路的激活参与了慢阻肺炎性反应[5]。因此本研究将在前期研究基础上，进一步探讨PM2.5是否通过Wnt-5a/JNK信号通路调控气道上皮细胞IL-6和TNF-α的分泌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及动物：人支气管上皮细胞系16HBE (广州医科大学提供)；18只雌性SD大鼠(体质量180～200 g，6～8周龄)饲养于广州医科大学附属第一医院动物实验研究中心内，饲养实验条件参照之前的研究[6]。

1.1.2 试剂(盒)及PM2.5的方案：DMEM培养基(Gibco公司)；无翼型整合位点家族成员5a (Wingless-related integration site 5a，Wnt-5a)、Wnt-5a siRNA、JNK(c-Jun-N terminal kinase，JNK)、c-Jun、p-JNK和p-c-Jun(Santa Cruz公司)；SP600125(Sigma-Aldrich公司)；IL-6 和TNF-αELISA试剂盒(R&D公司)。直径≤2.5 μm 的细颗粒物(fine particulate matter≤2.5 μm in diameter，PM2.5)采集自广东省广州市东风西路繁忙道路旁，采集的标本冻存于-80 ℃备用，标本的详细信息和分析方法参照之前的研究[6]。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理：本研究分大鼠和16HBE两部分。将大鼠分为清洁空气对照组，吸入机动车尾气组(机动车尾气浓度1.5 mg/m3，2 h/d，1个月)。在机动车尾气暴露室，PM2.5浓度是(1.46±0.03)mg/m3。最后通过腹腔内注射戊巴比妥(100 mg/kg)将大鼠处死，双肺用4%多聚甲醛(pH 7.40)固定24 h，将肺组织包埋于石蜡中，切成4 μm厚的切片；人支气管上皮细胞系16HBE按2×10-5个细胞/瓶将细胞接种于6孔板中，使细胞增殖达到60%～70%汇合。将细胞分为对照组、PM2.5(20 μg/mL)组、阴性对照siRNA+PM2.5组、Wnt-5a siRNA+PM2.5组、Wnt-5a siRNA+对照组、JNK抑制剂SP600125+PM2.5组、SP600125+对照组(每组设3个复孔)。细胞干预前24 h将细胞接种于6孔培养板，当细胞汇合达60%时，分别预先加入Wnt-5a siRNA、阴性siRNA培养24 h或SP600125培养1 h，再继续加入PM2.5刺激培养24 h。

1.2.2 免疫组化检测肺组织中p-JNK和p-c-Jun蛋白的表达：将肺组织切片脱蜡水化,并分别与p-JNK抗体(1∶100)和p-c-Jun抗体(1∶100)在室温下孵育1 h，洗涤后，加羊抗鼠HRP二抗，室温下孵育1 h，DAB 法显色。在共聚焦显微镜(×200)下进行评估，使用半定量评分系统对p-JNK和p-c-Jun阳性细胞的吸光度进行定量。

1.2.3 Western blot检测16HBE细胞中Wnt-5a、p-JNK、p-c-Jun蛋白的表达：提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取 50 μg蛋白上样，电泳结束后将目的蛋白转移到PVDF膜上(200 mA，2 h)，加Wnt-5a抗体(1∶1 000)、p-JNK抗体(1∶1 000)、p-c-Jun抗体(1∶1 000)、GAPDH抗体(1∶5 000)室温下孵育1 h。DAB 法显色，电泳凝胶成像分析仪采集结果。用Image J图像分析系统进行吸光度值分析。结果以目的蛋白的吸光度值除以内参GAPDH的吸光度值表示。

1.2.4 ELISA检测16HBE中IL-6和TNF-α的分泌:按ELISA试剂盒说明书进行测定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 机动车尾气(motor vehicle exhaust,MVE)暴露对大鼠肺组织p-JNK和p-c-Jun蛋白表达水平的影响

MVE组大鼠支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞p-JNK和p-c-Jun表达显著高于对照组(P<0.05)(图1)。

A.representative expression of p-JNK and p-c-Jun(×200)；B.statistical analysis of p-JNK and p-c-Jun A value；*P<0.05 compared with control group图1 免疫组化检测大鼠肺组织p-JNK和p-c-Jun蛋白的表达Fig 1 Immunohistochemistry examined the expression of p-JNK and p-c-Jun in the lungs of

2.2 不同处理组16HBE细胞中Wnt-5a蛋白表达的比较

与PM2.5组相比，Wnt-5a siRNA+PM2.5组Wnt-5a的表达显著减少(P<0.05)；与对照组相比，Wnt-5a siRNA+对照组Wnt-5a的表达显著减少(P<0.05)(图2)。

A.effects of Wnt-5a siRNA on expression of Wnt-5a；B.statistical analysis of Wnt-5a protein expression level；#P<0.05 compared with control group；*P<0.05 compared with PM2.5 group图2 Western blot检测16HBE细胞中的Wnt-5a蛋白表达水平Fig 2 Western blot examined the expression of

2.3 不同处理组16HBE中p-JNK和JNK蛋白表达的比较

与对照组相比，PM2.5组p-JNK蛋白的表达明显增加(P<0.05)；与PM2.5组相比，Wnt-5a siRNA+PM2.5组p-JNK蛋白的表达明显减少(P<0.05)(图3)。

A.effects of Wnt-5a siRNA on expression of p-JNK and JNK；B.statistical analysis of p-JNK/JNK ratio；#P<0.05 compared with control group；*P<0.05 compared with PM2.5 group图3 Western blot检测16HBE中p-JNK和JNK的蛋白表达水平Fig 3 Western blot examined the expression of p-JNK and JNK in

2.4 不同处理组16HBE中p-c-Jun和c-Jun蛋白表达的比较

与对照组相比，PM2.5组JNK的下游蛋白p-c-Jun的表达明显增加(P<0.05)；与PM2.5组相比，Wnt-5a siRNA+PM2.5组p-c-Jun蛋白的表达明显减少(P<0.05)(图4A，B)，SP600125+PM2.5组p-c-Jun蛋白的表达明显减少(P<0.05)(图4C，D)。

A.effects of Wnt-5a siRNA on expression of p-c-Jun and c-Jun；B.statistical analysis of p-c-Jun/c-Jun ratio；C.effects of SP600125 on expression of p-c-Jun and c-Jun；D.statistical analysis of p-c-Jun/c-Jun ratio；#P<0.05 compared with control group；*P<0.05 compared with PM2.5 group图4 Western blot检测16HBE中的p-c-Jun和c-Jun蛋白表达水平Fig 4 Western blot examined the expression of p-c-Jun and c-Jun in

2.5 不同处理组16HBE中分泌炎性因子IL-6和TNF-α的比较

与对照组相比，PM2.5组IL-6和TNF-α的分泌明显增加(P<0.05)；与PM2.5组相比，Wnt-5a siRNA+PM2.5组IL-6和TNF-α的分泌明显减少 (P<0.05)(图5A)，SP600125+PM2.5组IL-6和TNF-α的分泌明显减少(P<0.05)(图5B)。

A.effects of Wnt-5a siRNA on the secretion of IL-6 and TNF-α；B.effects of SP600125 on the secretion of IL-6 and TNF-α；#P<0.05 compared with control group；*P<0.05 compared with PM2.5 group图5 ELISA检测16HBE中IL-6和TNF-α的分泌Fig 5 ELISA examined the secretion of IL-6 and TNF-α in

3 讨论

近年来大量流行病学研究发现空气污染中的 PM2.5可增加慢阻肺的发病率、急性加重风险、肺功能下降及病死率[7]。PM2.5 可避开上呼吸道的保护作用直接进入下呼吸道，直接或间接(代谢产物、后续急慢性炎性反应)损伤肺组织，对人体的危害最大。气道上皮细胞作为呼吸道对抗有害气体和颗粒的第一道解剖屏障，在慢阻肺的发生发展过程中有着关键作用[8]，可以通过释放一系列炎性因子如TNF-α和IL-6等参与慢阻肺气道结构重塑，最终导致不可逆气流受限。本研究发现大鼠暴露于机动车尾气可诱导肺组织p-JNK和p-c-Jun上调。PM2.5诱导16HBE细胞中Wnt-5a、p-JNK和p-c-Jun表达上调，并诱导IL-6和TNF-α的分泌，提示Wnt-5a/JNK信号通路可能参与PM2.5相关慢阻肺气道炎性反应的过程。

Wnt-5a属于Wnts蛋白家族成员之一，是一种富含半胱氨酸结构域的分泌性糖蛋白，其表达水平与某些肺部疾病直接或间接相关。研究表明慢阻肺患者诱导痰中Wnt-5a表达上调且与气道阻塞程度成正相关[3]。在慢阻肺大鼠模型中，CSE和炎性因子协同作用上调Wnt-5a的表达，抑制 Wnt-5a的表达能改善肺功能[9]。PM2.5诱导气道上皮细胞中Wnt-5a的表达[10]。上述研究提示Wnt-5a的表达调控及其信号传导与PM2.5相关的慢阻肺气道炎性应答密切相关。

Wnt-5a可作为重要的炎性介质通过非经典Wnt通路诱导JNK的活化。JNK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞的增殖、分化及凋亡的过程中发挥重要的作用，与细胞的应激反应及炎性反应有明显的关系。研究发现PM2.5暴露的动物模型中JNK的表达上调[11]。本研究显示Wnt-5a siRNA抑制了PM2.5诱导16HBE中JNK和c-Jun磷酸化、p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun比值，也抑制了IL-6和TNF-α分泌。各种刺激因子可诱导支气管上皮细胞中p-JNK的表达[12]。JNK抑制剂SP600125抑制PM2.5促进人成纤维细胞中IL-6的产生[13]。本研究结果进一步提示SP600125降低了PM2.5诱导16HBE中p-c-Jun/c-Jun比值及IL-6和TNF-α的分泌。这说明Wnt-5a/JNK信号通路在PM2.5诱导16HBE分泌的IL-6和TNF-α中起重要作用。

综上所述，Wnt-5a可能通过促进p-JNK和p-c-Jun的表达参与了PM2.5诱导的人支气管上皮细胞系IL-6和TNF-α炎性因子的分泌，从而促进了PM2.5相关慢阻肺患者的气道炎性反应。该研究为有针对性的治疗慢阻肺寻找有效的药物新靶点提供了理论依据。