两种测定人血浆中维生素E 方法的比较分析

谢宝英

维生素E 具有强大的抗氧化和清除自由基的作用,是人体必须的微量物质之一。体、内外实验表明,维生素E 是非常重要的阻断自由基链式反应的抗氧化剂,不但能够预防和减轻体内细胞膜脂质过氧化物的破坏,保持组织的完整性,而且在生命活动中起着极其重要的作用,具有防癌、抗衰老等功能。维生素E 由8 种异构体构成,其中α-生育酚的生理活性和抗氧化能力最强。近几年已应用维生素E 作为一些疾病辅助治疗及抗衰老的药物,市场上维生素E 制品基本以α-生育酚醋酸酯形式出现。目前维生素E 的测定方法主要包括气相色谱法［1,2］、高效液相色谱法［3-5］、紫外光谱法等［6］。紫外光谱法专属性不强,故使用导数光谱法,但操作非常复杂。近年来国内外多采用专属性强、简便快速的色谱法测定,中国药典中维生素E 及其制剂的测定方法为气相色谱法。色谱法还可应用到血浆中维生素E 的测定中。本试验拟比较毛细管气相色谱法和高效液相色谱法测定人血浆中维生素E 浓度的准确性、灵敏度等,确定适用于维生素E 血药浓度监测的方法并探讨其原因。现报告如下。

1 仪器与试药

GC-2010 气相色谱仪包括氢火焰离子化检测器,Labsolutions GC solution 色谱工作站(日本岛津)。LC-10A 高效液相色谱仪包括SPD-10A 紫外检测器,Chromato-solution Light 色谱工作站(日本岛津)。空白血浆由厦门市中心血站提供。维生素E 对照品(98.9%)为蒂斯曼(上海)有限公司产品,正三十二烷(99.9%)为日本东京化成工业株式会社产品。实验用水为去离子水,甲醇为色谱级试剂,正己烷、无水乙醇等为分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 气相色谱法 色谱柱为Rtx-1 毛细管柱(30.00 m×0.25 mm,0.25 μm),载气为氮气,流速为10 ml/min,气化室温度为300℃,柱温为290℃,FID 温度为300℃。精密量取100 µl 血浆,置塑料离心管中,分别加入150 µl 水和350 µl 无水乙醇,涡旋1 min,精密加入500 μl 内标溶液(取正三十二烷适量,精密称定,加正己烷溶解,稀释成10 μg/ml 的内标溶液),涡旋1 min 后,于4000 r/min 离心5 min,吸取上清液,氮气吹干,精密加入100 μl 正己烷,涡旋混匀1 min,于10000 r/min 离心3 min,取2 µl 上清液注入气相色谱仪进行分析。

2.1.2 高效液相色谱法 色谱柱为岛津VP-ODS C18柱(250.0 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇,流速为1.5 ml/min,检测波长为254 nm,柱温为室温。精密量取100 µl 血浆,置塑料离心管中,分别加入150 µl 水和350 µl 无水乙醇,涡旋1 min,加500 μl 正己烷,涡旋1 min 后,于4000 r/min 离心5 min,吸取全部上清液,氮气吹干,精密加入100 μl 甲醇,涡旋混匀1 min,于10000 r/min 离心3 min,取10 µl 上清液注入液相色谱仪进行分析。

2.2 标准溶液的配制 取维生素E 对照品12.5 mg,精密称定,置50 ml 容量瓶中,加无水乙醇溶解,稀释至刻度,摇匀,即得0.25 mg/ml 的维生素E 贮备液,置冰箱中保存。临用时精密吸取贮备液,用无水乙醇稀释至刻度,配制成系列标准溶液。

2.3 专属性试验 取两份空白血浆100 µl 按两种前处理方法操作,另取两份空白血浆80 µl,精密加入维生素E 标准溶液20 µl,涡旋混匀,分别按两种前处理方法操作,在各自的色谱条件下血浆内源性物质不干扰药物的测定,专属性较好。气相色谱条件下,维生素E 的保留时间(tR)为17.4 min,内标tR为17.9 min,两者分离度为1.4。高效液相色谱条件下,维生素E 的tR为11.55 min。见图1。

图1 气相色谱法和高效液相色谱法的色谱图

2.4 标准曲线 取塑料离心管数支,加入空白血浆80 µl,分别精密加入维生素E标准溶液20 µl,涡旋混匀,配制系列含药血浆。其血浆药物浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/ml。分别按两种前处理方法操作,在各自的色谱条件下进样,记录色谱图。

气相色谱法以维生素E 的浓度C 为横坐标,维生素E 的峰面积As 与内标物的峰面积Ar 的比值f为纵坐标,求回归方程,标准曲线为f=0.039C+0.005,r=0.9985,在0.5～10.0 µg/ml 范围内线性关系良好。根据信号噪音比值,得血浆中最低定量限为0.501 μg/ml,相对标准偏差(RSD)为11.3%(n=5)。高效液相色谱法以维生素E 的浓度C 为横坐标,峰面积A 为纵坐标,求回归方程。由于灵敏度较低,血浆药物浓度两个低浓度点没有信号,故未计算标准曲线。

2.5 提取回收率试验 取空白血浆80 µl,精密加入不同浓度的维生素E标准溶液,使其成为血浆药物浓度为0.8、2.5、10.0 μg/ml 的低、中、高三种浓度的血浆样品,每个浓度平行配制6 份,分为两组,分别按两种前处理方法操作,在各自的色谱条件下进样,记录色谱图。

用气相色谱法时计算维生素E 峰面积As 与内标的峰面积Ar 的比值f。另取塑料离心管数支,分别精密加入相应浓度的维生素E 溶液,内标溶液500 μl,氮气吹干,再精密加入100 μl 正己烷,涡旋混匀1 min,于10000 r/min 离心3 min,取上清液2 μl 进样,计算维生素E 峰面积As’与内标的峰面积Ar’的比值f’。以f 与f’之比计算提取回收率。高效液相色谱法的维生素E 峰面积为A,另取塑料离心管数支,分别精密加入相应浓度的维生素E 溶液,氮气吹干,精密加入100 μl 甲醇,涡旋混匀1 min,于10000 r/min 离心3 min,取上清液10 μl 进样,维生素E 峰面积为A’。以A 与A’之比计算提取回收率。结果见表1,气相色谱法提取回收率较好,高效液相色谱法的提取回收率低,影响方法的准确度。

表1 回收率试验结果(n=3)

2.6 气相色谱法精密度试验 取空白血浆80 µl,精密加入不同浓度的维生素E 标准溶液,使其成为血浆药物浓度为0.8、2.5、10.0 μg/ml 的低、中、高三种浓度的血浆样品,每个浓度平行配制3 份,共9 份作为一批,在同日内按气相色谱法的前处理方法和色谱条件测定,计算日内精密度。连续3 d,重复同样的操作,测定三批血浆样品,计算日间精密度。结果见表2,RSD均＜15%,分析精密度良好。

表2 精密度试验结果(n=3)

2.7 气相色谱法稳定性试验 将血浆样品在-20℃冷冻前、冷冻24 h 后于室温自然解冻、室温放置8 h、冷冻30 d 以及在-20℃和室温下反复冻融3 次后按气相色谱法的前处理方法和色谱条件测定,计算血浆药物浓度。结果维生素E 含量基本不变,表明血浆中维生素E 在-20℃冷冻储存、解冻8 h 以及反复冻融的情况下是稳定的。

3 讨论

本试验比较了两种测定血浆中维生素E 的方法,从结果上看气相色谱法优于高效液相色谱法。分析其原因,认为是血浆样品的前处理方法以及定量方法造成的。血浆样品的分析一般采取一次萃取的方式,故提取率不高。本试验中高效液相色谱法的定量方法是外标法。外标法简便,但进样量须十分准确,并且前处理方法必须能够完全将药物从基质中提取出来,否则将会造成分析方法误差,得不到准确的测量结果。高效液相色谱法本身的进样是准确的,但在该血浆样品的前处理时损失了药物,最终该方法的准确度低。RSD值偏大,说明提取效果不稳定。本试验的另一方法气相色谱法使用内标法定量,即在分析测定时,从样品的前处理开始加入一内标物,通过测量被测组分及内标物的峰面积的比值来进行计算,以消除操作条件(包括萃取、进样等操作)的波动对分析结果产生的影响,提高分析结果的准确度。由于气相色谱法本身进样的不准确性,一般采用内标法定量。在本试验中,内标的使用同时还消除了萃取过程的误差,所以气相色谱法回收率、精密度等指标均符合要求。由于气相色谱法更适合该样品的测定,本试验重点研究了气相色谱法的测定条件,具体如下。①维生素E 是弱极性化合物,选用中等极性色谱柱时药物和内标不能完全分离。随后选用非极性色谱柱,维生素E 与固定相有较强的亲和力,虽然延长了分析时间,但内源性物质、药物和内标都能达到基线分离,效果较好。②柱温的选择参照中国药典2015 版二部,在265℃下,20 min 内没有出峰。试验考察了270、280、290、300℃时的色谱分离情况,最终确定柱温为290℃。③血浆样品处理时加入水和乙醇的作用是沉淀血浆中的蛋白,再加正己烷萃取血浆中的维生素E。血浆样品萃取后,曾经选择无水乙醇将残渣溶解,但实验结果表明重现性较差,因正三十二烷为非极性物质,在无水乙醇中不能完全溶解,在用无水乙醇复溶时,离心管内壁上附有少量白色物质。最后改用正己烷复溶,能完全溶解残渣。

本试验中的毛细管气相色谱法采用正己烷对血浆样品进行萃取,与固相萃取法比较费用低,操作简便易行,具有选择性强,灵敏度高,简便、快速、准确的特点,可用于维生素E 药动学研究和血药浓度检测。