狄斯瓦螨和蜜蜂病毒对意大利蜜蜂蜂群越冬的影响

邓 洁，王 帅，陈功文，胡福良，郑火青

(浙江大学动物科学学院，杭州 310058)

蜜蜂是一种重要的经济昆虫，不仅能生产蜂产品，还能通过为植物授粉提高农作物产量和质量及维护生态平衡(Pottsetal., 2016)。然而，近几十年来，北美、欧洲、非洲等地的蜂群损失加剧，对农业授粉和生态系统安全造成严重威胁(Aston, 2010; Pirketal., 2014; Leeetal., 2015)。

引起蜂群损失的因素包括病原微生物、寄生螨、外界环境、农药、杀螨剂和生产压力等，其中狄斯瓦螨Varroadestructor和蜜蜂病毒被认为是影响蜜蜂健康的两大主要生物因素(Goulsonetal., 2015; Nazzi and Pennacchio, 2018)。狄斯瓦螨是一种蜜蜂体表寄生虫，除影响蜜蜂发育外，还能携带、传播蜜蜂病毒，甚至降低蜜蜂的免疫力，使蜜蜂体内的病毒有机会大量增殖(Dainatetal., 2012; Nazzietal., 2012)。狄斯瓦螨与蜜蜂病毒的这种协同作用对蜂群健康产生系统性影响(Rosenkranzetal., 2010)。已知感染蜜蜂的病毒达30多种(Remnantetal., 2017；Schoonvaereetal., 2018)，其中最常见的包括急性蜜蜂麻痹病毒(Acutebeeparalysisvirus, ABPV)、黑蜂王台病毒(Blackqueencellvirus, BQCV)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronicbeeparalysisvirus, CBPV)、残翅病毒(Deformedwingvirus, DWV)、以色列急性麻痹病毒(Israeliacuteparalysisvirus, IAPV)、克什米尔蜜蜂病毒(Kashmirbeevirus, KBV)和囊状幼虫病毒(Sacbroodvirus, SBV)。这些常见病毒中，在我国西方蜜蜂Apismellifera群中流行率最高的是DWV和BQCV(Lietal., 2012; 丁桂玲和石巍, 2015)。

越冬期是西方蜜蜂蜂群最易出现损失的阶段(Desaietal., 2012)。例如，2013-2014年，美国西方蜜蜂蜂群在越冬期的损失占全年蜂群损失的87.7%(Leeetal., 2015)。Genersch等(2010)对德国蜂群损失现象进行了5年的跟踪调查，发现狄斯瓦螨在冬季蜂群损失中起到了关键作用。Dainat等(2012)的研究证明，在蜜蜂的主要病虫害中，狄斯瓦螨和蜜蜂病毒(主要为DWV)是冬季蜂群死亡的两个最主要的预测指标。

Liu等(2016)在2010-2013年对我国 12个省份的越冬蜂进行调查，发现我国越冬期蜂群的年平均损失约为77万群，约占我国饲养蜂群总数的10.1%。近年来，西方蜜蜂(主要为意大利蜜蜂，简称意蜂)在我国江浙一带也出现了大量损失的现象(郑火青等, 2016; 华启云等, 2016)，初步调查表明狄斯瓦螨、蜜蜂病毒、微孢子虫等是导致这些损失的主要原因(郑火青等, 2016)。陈功文等(2018)研究了浙江省3个意蜂蜂场的蜂群越冬前与越冬后的病毒感染情况，认为IAPV是影响越冬期意蜂健康的最主要病毒。

为进一步探析影响越冬期意蜂健康的因素及其相互关系，本文研究了蜂螨寄生率差异较大的45个意蜂群的常见病毒感染情况、狄斯瓦螨寄生率以及蜂群越冬表现，以期为减少越冬期蜜蜂死亡提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 蜂群准备和样品采集

1.1.1供试蜂群准备

2018年8月，在位于浙江绍兴的实验蜂场准备45个群势基本一致(10～12框蜂)的意蜂群。实验前，所有蜂群采取同样的生产管理措施，并及时防治蜂螨。8月后，所有蜂群都不治螨，直至12月中旬。浙江意蜂越冬期一般在11月中旬至12月下旬之间，10月中旬开始繁殖越冬蜂。本试验中，在10月初蜂群蜂螨寄生率已普遍达到较高水平，且从11月开始蜂群逐渐出现死亡，于10月初采集繁殖越冬蜂前的蜜蜂样本共45份，12月中旬采集越冬期存活的蜜蜂样本共28份。

1.1.2样品采集

每个蜂群随机采集约100头成年工蜂，其中30头用于常见病毒检测，30头用于微孢子虫感染情况鉴定。为检测各个蜂群的蜂螨寄生率，10月初取样时，在每个蜂群随机分散性地割取3块封盖子脾(每块巢脾不少于100个封盖巢房)。因越冬期蜂群无封盖子，本实验未测定越冬期蜂群巢房内蜂螨寄生率。

1.2 微孢子虫孢子计数

1.3 狄斯瓦螨寄生率检测

逐一打开封盖巢房，仔细检查是否有狄斯瓦螨寄生。狄斯瓦螨寄生率为有瓦螨的巢房数占检查的巢房总数的比例。

1.4 RNA提取

取30头蜜蜂，在研钵内加液氮后将其研磨至粉末，取粉末170 mg于1.5 mL离心管中，加入1 mL RL裂解液，充分震荡后室温放置15 min，参照RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒(TaKaRa，日本)的操作说明提取总RNA，用NanoDrop 2000紫外分光光度计(Thermo Fisher，美国)测定所提RNA的浓度。

1.5 反转录反应

采用FSQ-201反转录试剂盒(TaKaRa，日本)。于200 μL离心管中加入800 ng RNA，65℃孵育5 min后置于冰上快速冷却，在离心管中加入4 μL 5×RT Master Mix；再用RNase free water补足体积至20 μL。离心管震荡离心后进行反转录，反转录条件为：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，然后置于-20℃备用。

1.6 常见蜜蜂病毒定量检测

采用qRT-PCR定量检测ABPV、BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV等6种常见蜜蜂病毒。配制10 μL qPCR反应体系，其中cDNA模板1 μL，上游和下游引物各0.5 μL(引物序列见表1)，TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)5 μL以及3 μL的RNase free water，以H2O替代cDNA为空白对照。荧光定量PCR扩增程序为：95℃，1 min；40个循环反应：95℃ 15 s，60℃ 1 min；熔解曲线：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。

表1 定量检测ABPV、BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV的引物序列

参照温政胜(2019)的方法对BQCV、DWV、IAPV等3种病毒基因组拷贝数进行绝对定量。将质粒标准品以10倍浓度梯度依次稀释6个不同的浓度，以不同浓度的质粒溶液为模板进行荧光定量PCR，并建立各病毒定量的标准曲线，通过标准曲线和每个样本对应的CT值计算目标病毒的基因组拷贝数。

1.7 统计分析

病毒基因组拷贝数与狄斯瓦螨寄生率间的相关性采用线性回归(linear regression)方法进行分析，其它参数的显著性分析采用单因素方差(one-way ANOVA)进行分析。所有的统计分析均在SPSS 21.0(IBM, 美国)中进行。

2 结果与分析

2.1 蜂群病原感染情况和越冬表现

本实验中的蜂群受微孢子虫感染程度很轻。在所有的样本中，仅在繁殖越冬蜂前的3个蜂群样本中检测到微孢子虫，且孢子数均低于5×104个/蜜蜂，因此未将蜂群微孢子虫感染情况纳入后续分析。经过两个月的不治螨管理，86.67%蜂群检测到蜂螨寄生，且不同蜂群封盖巢房的瓦螨寄生率差异较大(0～39.9%)。

在繁殖越冬蜂前，蜂群中仅检测出了DWV和IAPV，感染率分别为100%和97.78%，未检测到ABPV、BQCV、CBPV和SBV。在越冬期，除了DWV和IAPV，还检测到了BQCV，DWV和IAPV的蜂群感染率均达到了100%，BQCV的感染率为88.89%。在两个取样时间点之间，共有17群蜜蜂死亡。

2.2 繁殖越冬蜂前蜂群狄斯瓦螨寄生率和病毒基因组拷贝数相关性分析

通过对繁殖越冬蜂前蜂群狄斯瓦螨寄生率和病毒基因组拷贝数的相关性进行分析，发现瓦螨寄生率与蜂群DWV和IAPV病毒基因组拷贝数间存在显著正相关关系(DWV:R2=0.435,p=0.003; IAPV:R2=0.499,p=0.001; 图1-a)。尝试在不同的瓦螨寄生率范围内分析瓦螨寄生率和病毒量的相关性，发现瓦螨感染率低于9%的蜂群DWV基因组拷贝数与瓦螨感染率间显示出更高的相关性(R2=0.524,p=0.002, 图1-b)，IAPV基因组拷贝数与瓦螨感染率间的相关系数则明显更低(R2=0.241,p=0.183)。而瓦螨感染率超过9%的蜂群IAPV基因组拷贝数与瓦螨感染率相关性更高(DWV:R2=0.072,p=0.816; IAPV:R2=0.626,p=0.029, 图1-c)。

图1 不同狄斯瓦螨寄生率与DWV和IAPV基因组拷贝数的关系Fig.1 The correlation between infestation rate of Varroa destructor and genomic copies of DWV and IAPV 注：(a)，所有蜂群狄斯瓦螨寄生率与DWV和IAPV基因组拷贝数的相关性；(b)，狄斯瓦螨寄生率小于9%时与DWV和IAPV基因组拷贝数的相关性； (c)，狄斯瓦螨寄生率大于9%时与DWV和IAPV基因组拷贝数的相关性。Note：(a)，Correlation between infestation rate of V. destructor and genomic copies of DWV and IAPV of all colonies;(b)，Correlation between infestation rate of V. destructor (<9%) and genomic copies of DWV and IAPV;(c)，Correlation between infestation rate of V. destructor (>9%)and genomic copies of DWV and IAPV.

2.3 死亡蜂群和存活蜂群在繁殖越冬蜂前的蜂螨寄生率和病毒感染情况比较

死亡的17个蜂群在10月初取样时蜂螨寄生率达到了12.83%±2.25%，显著高于存活的蜂群同期取样时的蜂螨寄生率(4.48%±1.47%；χ2检验，χ2=0.269，p=0.034，图2-a)；且前者的平均IAPV基因组拷贝数也显著高于后者(one-way ANOVA，p=0.033；图2-b)，但两者在DWV基因组拷贝数上无显著差异(one-way ANOVA，p=0.114；图2-b)。

图2 死亡蜂群与存活蜂群的比较Fig.2 Comparison between dead and alive colonies注：(a)，狄斯瓦螨寄生率比较；(b)，DWV及IAPV病毒基因组拷贝数比较。“*”表示在P<0.05水平差异显著。Note：(a)，Infestation rate of V. destructor;(b)，Viral genome copies of DWV and IAPV. “*” represented significant difference while P<0.05.

2.4 存活蜂群在繁殖越冬蜂前和越冬期病毒基因组拷贝数比较

通过对存活蜂群在繁殖越冬蜂前与越冬期的病毒基因组拷贝数的分析，发现存活蜂群在两个时间点之间的DWV、IAPV平均病毒基因组拷贝数均无显著差异(one-way ANOVA，pDWV=0.242；pIAPV=0.818；图3)。存活蜂群在繁殖越冬蜂前未检测到BQCV，在越冬期BQCV病毒基因组拷贝数也很低。

图3 存活蜂群繁殖越冬蜂前与越冬期病毒基因组拷贝数比较Fig.3 Comparison on viral genome copies of surviving colonies between before overwinterinng and during overwintering period

3 结论与讨论

为使蜂群蜂螨寄生率达到较高水平，本研究在实验期间停止治螨。在10月初时，蜂群间蜂螨寄生率已存在较大差异，部分蜂群蜂螨寄生率达到很高的水平，这可能和不同蜂群的抗螨能力差异或实验前不同蜂群蜂螨寄生率存在差异有关。这种差异化的蜂螨寄生率和越冬表现也为本研究的开展创造了条件。

微孢子虫是影响蜜蜂健康的重要因素(许瑛瑛等, 2018)。Botias等(2013)研究发现微孢子虫感染与蜜蜂的寿命缩短及冬季死亡率增加有关。但在本研究中，蜂群微孢子虫感染率很低，可以排除在本实验中微孢子对蜂群越冬期健康的显著影响。通过对实验蜂群进行几种常见蜜蜂病毒的检测，本研究发现其主要感染DWV、IAPV和BQCV等3种病毒，这与此前陈功文等(2018)的研究结果相似。BQCV在繁殖越冬蜂前的蜂群中并未检测出，在越冬期的蜂群中检出率达到88.89%，这可能和实验期间蜂群健康水平持续下降致使蜂群携带的病毒出现增殖有关。但即使在越冬期，BQCV病毒基因组拷贝数也处于较低水平。因此，可以认为BQCV也不是影响越冬期蜜蜂健康的主要因素。

在本实验过程中，共有17个蜂群死亡，其中死亡蜂群的蜂螨寄生率和IAPV病毒量在繁殖越冬蜂前都显著高于存活蜂群，说明蜂螨寄生率和IAPV病毒量是意蜂群越冬期健康的重要影响因素，进一步验证了陈功文等(2018)中“IAPV是影响意蜂越冬期健康的最主要病毒”的结论。

狄斯瓦螨对意蜂蜂群健康产生系统性影响。众多研究都表明狄斯瓦螨寄生率是影响西方蜜蜂蜂群越冬期健康的重要因素(秦瑶等, 2018)。例如，Guzman-Novoa等(2010)的调查表明加拿大安大略省超过85%的冬季死亡蜂群与秋季瓦螨感染相关；Genersch等(2010)对德国蜜蜂越冬期寿命降低原因的调查发现，DWV和瓦螨的共同作用缩短了冬季蜜蜂的寿命。本研究结果也清晰地表明蜂群繁殖越冬蜂前的狄斯瓦螨寄生率是影响越冬期蜂群健康的最重要因素。

狄斯瓦螨和多种蜜蜂病毒存在直接或间接的协同作用，瓦螨感染率高的蜂群会增加DWV和IAPV传播的机会，并增加蜜蜂被病毒侵染的可能性(Cox-Fosteretal., 2007；Schroeder and Martin, 2012)。同时，瓦螨也能被DWV、BQCV等蜜蜂病毒侵染(Wangetal., 2019)。瓦螨迁移时，也会加速病毒的传播。Kielmanowicz等(2015)的研究表明，当狄斯瓦螨寄生率小于3%时，DWV感染程度与蜂群瓦螨寄生率呈正相关，而当瓦螨寄生率大于3%时，DWV和IAPV两种病毒的基因组拷贝数与瓦螨寄生率都有显著的线性关系。在西班牙南部，通过对蜂群内4种蜜蜂病毒(DWV、BQCV、SBV和IAPV)的感染与狄斯瓦螨的寄生情况进行调查，发现狄斯瓦螨和DWV是影响蜂群健康的主要因素(Barroso-Arevaloetal., 2019)。本实验中，DWV、IAPV感染程度和瓦螨寄生水平之间也呈线性正相关(图1)。随着狄斯瓦螨的寄生率上升，DWV和IAPV病毒量也呈上升趋势，但两种病毒的增长趋势存在差异。当瓦螨寄生率较小时(小于9%)，DWV病毒量与瓦螨寄生率的相关性较高；而当瓦螨寄生率较高时(大于9%)，IAPV病毒量与瓦螨寄生率的相关性更高。与IAPV相比，DWV在不同瓦螨感染率的蜂群中病毒拷贝数差异不显著，可能是因为DWV的致病力相对于急性病毒IAPV较弱(Schroeder and Martin, 2012)，IAPV对高瓦螨感染蜂群的致病效果更为显著。

本研究表明，狄斯瓦螨和IAPV病毒的协同作用是影响意蜂蜂群越冬表现的综合因素。结合这两项指标自身存在的紧密正相关性，养蜂生产中，在繁殖越冬蜂前将狄斯瓦螨寄生率控制在较低水平(9%以下)，是减少越冬期蜜蜂死亡的重要措施。