玉米加工副产品黄曲霉毒素的检测

范红霞

诸城兴贸玉米开发有限公司 山东诸城 262200

1 黄曲霉毒素的危害

黄曲霉毒素对人和读物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关。研究发现，黄曲霉毒素具有很强的致癌性、致突变性和致畸性，能使鱼类、禽类、家畜和灵长类动物诱发实验性肝癌，只要病变为肝脏出血、坏死、胆管增生、肝硬化等。经大量的流行病学调查证实，黄曲霉毒素的高摄入量和人类肝癌的发病率密切相关。

2 玉米加工副产品黄曲霉毒素检测方法综述

目前黄曲霉毒素检测常用的方法如下几种：

2.1 薄层层析法（TLC）

TLC法是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将霉菌毒素从样品中提取出来，经柱层析净化，再在薄层板上层析展开、分离，利用霉菌毒素的荧光性，根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。

2.2 色谱法

色谱法包括薄层色谱，气相色谱、液相色谱等，一直是最重要的霉菌毒素的化学分析方法。现在比较普遍的霉菌毒素的分析方法还是液相色谱法，包括液相色谱-质谱联用技术。

2.3 荧光光度法（IAC/SAB）

试样经过甲醛水提取，提取液经过过滤、稀释后，滤液经过含有AFT特殊抗体的免疫亲和柱净化。此抗体对AFT具有专一识别能力。AFT键合在分离柱中的抗体上。用蒸馏水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过分离柱洗脱。加显色剂于专用的荧光剂测定样品中法AFT含量。

2.4 酶联免疫法（ELISA）

ELISA法也是近年来研究出来的一种较为新颖的方法。是将抗体抗元反应的特异性和酶与底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫分析技术。样品中的黄曲霉毒素B1与定量特异抗体反应，多余的游离抗体与固相包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准线比较计算含量。

在这里我主要是研究黄曲霉毒素B1的ELISA方法。

3 实验部分

3.1 ELISA检测玉米副产品中黄曲霉毒素B1

3.1.1 设备与试剂

酶标仪（MK3芬兰雷勃公司），高速万能粉碎机（天津泰斯特），回旋式振荡器（HY-5），微量移液管（芬兰雷勃公司），分析天平（AL204型，量程10mg-210g，梅特勒.托利多公司），医用离心机（江苏欣康医疗），量筒25ML，三角瓶100mL，移液管25ML，离心管10ML，定性滤纸，，ELISE测试试剂盒（上海千慕生物技术有限公司）甲醇（AR级国药试剂公司），NaCl（AR级）

3.1.2 样品采集

本实验所用样品系于2021年3月17日从车间所取，根据国家取样标准在，采集有代表性的样品。

参照有关文件的方法进行样品制备，将样品粉碎后过筛，充分混合。取蛋白粉、喷浆玉米皮、胚芽饼各5克于100ml的容量瓶中，并添加1gNaCl，25ML70%甲醇水溶液，充分震荡3分钟；取10ML滤液以3500xg离心5分钟，收集上清液。即为待测样。

3.1.3 ELISA检测步骤

试剂的准备。从冰箱中取出黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒，平衡至室温，并在室温下保持至少1小时。

分析步骤：①预先安排好实验流程，记录好每个标准品/样品的位置；②添加100ul酶耦合剂到每个预混合孔；③添加50ulAFB1系列标准溶液（0ppb，1ppb，5ppb，20ppb，40ppb）和样品到相应的预混孔；④用微量移液枪，混合每个预混合孔中的内容物，立即将100ul转移到相应的抗黄曲霉毒素B1抗体包被的微孔中；⑤于室温孵育10分钟；⑥洗板孵育结束后倒掉孔中的液体、用稀释后的稀释液填满微孔，倒掉微孔中的液体，重复清洗三次；将微孔板倒扣在滤纸上并轻轻敲打，清除残留的液滴；⑦发展添加100ul发展液到每个微孔中，彻底混合几秒钟；⑧室温条件下孵育5分钟；⑨添加50ul终止液到每个微孔中，并彻底混合几秒中；10、在450nm处测定吸光度值，在15分钟内度数[1]。

4 结果与分析

将每个标准品/样品的吸光度值图一标准0（B0）的吸光度并乘以100、因此，最大结合（B0）等于100%，吸光度值以百分比表示；标准品吸光度值（或样品）/零标准品吸光度值×100=B/B0（%）根据每个标准品的B/B0值和黄曲霉毒素B1标准品浓度绘制曲线；将每个样品的B/B0值插入校准曲线中得到相应浓度。标准品浓度已经考虑了样品稀释因子，对于所做样品，如果提取物稀释5倍，则将所得浓度值乘以5[2]。

5 标准曲线

图1 Aflatoxin B1（PPb）

6 结果评估

样品序号 ID 吸光度值（mean）（CV）B/B0（%）计算（ppb） *= ppb（%）1 蛋白粉 1.187 0.0 78.8 1.3 5.0 6.7 2 喷浆玉米皮 0.925 0.0 61.4 3.3 5.0 16.4 3 胚芽饼 1.085 0.0 72 2.0 5.0 9.9 4 蛋白粉 1.116 0.0 74.1 1.8 5.0 8.8 5 喷浆玉米皮 0.712 0.0 47.3 6 5.0 30.0 6 胚芽饼 0.484 0.0 32.1 11.8 5.0 58.8

根据试剂盒给定的参数，所测样品均在数据要求的范围内，本次实验结果有效。

由于原料的不同，所测得的数据会得出不同的结果。