昆虫病原线虫JLSY 003的鉴定及其生物学特性测定

田成丽，李茂海，刘金文，张金花，朱 峰，李建平

（吉林省农业科学院植物保护研究所，公主岭 136100）

昆虫病原线虫（Entomopathogenic nematodes，EPNs）是在5 d之内对寄主昆虫的致死率达到50%以上的线虫[1]，主要分布在5个总科：尖尾总科Oxyuroidea、滑刃总科Aphelenchoidea、垫刃总科Tylenchoidea、小杆总科Rhabditoidea及索线虫总科 Mermithoidea。部分种类EPNs已被开发并广泛用于防治多种害虫。Oscheius属于小杆总科，Andrássy于 1976年首次建立了该属[2]，Oscheius属由取食细菌的自由生活线虫（Free-living nematodes，FLNs）和EPNs组成，共46个种[3-6]。

Oscheius属中的EPNs具有较高的致病力[7]，2015—2019年，全世界共分离鉴定出5种Oscheius属的EPNs，分别是O.indicusn.sp.[5]、O.basothoviin.sp.[6]、O.safricana[8]、O.microvilli[9]和O.onirici[10]。其中O.basothoviin.sp 在72 h内对黄粉虫幼虫Tenebriomolitor的致死率高达100%[6]；O.microvilli在浓度为320 IJs/mL，48 h时对大蜡螟的致死率为93.1%[9]；O.onirici对蔓越莓上的红头跳甲Systenafrontalis致死率为67%[11]，对Sparganothissulfureana幼虫的致死率为75%，对蓝莓上的日本斑翅果蝇Drosophilasuzukii蛹的羽化率降低了78.2%[12]。

George和Poinar[13]首次从美国的马陆Oxidisgracili中分离出O.myriophila，并命名，随后Erbaş等[14]和Al-Zaidawi等[15]从土耳其欧洲蝼蛄Gryllotalpagryllotalpa和伊拉克的土样中分离出O.myriophila，董腊梅[16]和张喆等[17]在中国土壤样品中分离获得该线虫。上述报道仅限于种类鉴定或与植物病原线虫的关系研究，均未对该线虫与昆虫的关系进行任何生物学测定。

来源于不同地理环境中的同种EPNs在抗逆性、侵染力及繁殖力等生物学特性方面常有差异，对EPNs的生物学特性的测定和评估等是决定一种EPNs是否有开发利用价值的依据。本研究对从吉林省土样中分离出的JLSY 003线虫进行了分子鉴定，测定了其致病力、耐高温性及繁殖力，目的是明确该线虫是否具有开发利用价值。

1 材料与方法

1.1 供试材料

昆虫病原线虫：O.myriophilaJLSY 003 分离自吉林省松原市（124°44′21″ E，44°55′ 36″ N）多年生人工林下0～20 cm表层土，本实验室保存。

大蜡螟GalleriamellonellaL.来自吉林省农业科学院植物保护研究所。

1.2 JLSY 003线虫的分子鉴定

参照田成丽等[18]和王江岭等[19]的单条线虫 DNA 提取方法。扩增线虫28S基因的保守区D2-D3，D2A：5′-AGCGGAGGAAAAGAAACTAA-3′[20]，D3B：5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′[21]。扩增线虫的 ITS rDNA：TW81：5′-GCGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′；AB28：5′-GCGGATCCATATGCTTAAGT TCAGCGGGT-3′[22]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

25 μL PCR 反应体系：12.5 μL Mix Taq DNA 聚合酶，ddH2O 8.5 μL，正反引物各 1 μL，DNA 模板 2 μL。反应程序参照Ye等[23]。产物分别由生工生物工程（上海）股份有限公司和北京六合华大基因测序部纯化、测序。所得序列登入GenBank的blastan（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对[24]，再利用MEGA 7软件构建系统发育树，分析待鉴定线虫与相关线虫的系统发育关系。

1.3 JLSY 003线虫的生物学特性

1.3.1 JLSY 003线虫对大蜡螟侵染力测定（LC50、LT50） 在铺有2层滤纸（直径为60 mm）的培养皿中放入10头大蜡螟，分别均匀滴入含20、40、80、160和320 IJs/larva的线虫悬浮液各1 mL，置于25 ℃、RH为75%的恒温避光培养箱中，3次重复，清水作为对照。每12 h记录大蜡螟的死亡数量，计算大蜡螟死亡率、校正死亡率、24 h和48 h时LC50和80、160 IJs/larva浓度下的LT50。大蜡螟死亡率（%）＝死亡大蜡螟虫口数量/供试大蜡螟虫口数量×100%；大蜡螟校正死亡率（%）＝（处理大蜡螟死亡率—对照大蜡螟死亡率）/（1—对照大蜡螟死亡率）×100%。

1.3.2 JLSY 003高温耐受性测定 参照Glazer[18,25]测定JLSY 003线虫在40、38和36 ℃下的高温耐受性。取新收集的浓度为1000 IJs/mL且存活力100%的线虫悬浮液5 mL，放入1.8 cm×7.5 cm的平底试管中，用封口膜封口后置于水浴锅中。每个处理3次重复，每20 min从试管中吸取100 μL线虫悬浮液放入加有1 mL无菌水的1.5 mL EP管中，在25 ℃恒温培养箱中放置24 h后，记录线虫的死亡数量。

1.3.3 JLSY 003产量测定 对每个重复侵染致死的（侵染剂量160 IJs/larva）大蜡螟幼虫进行称重，每10头大蜡螟为1组，3次重复。将死亡大蜡螟放入线虫收集盘[26]，待线虫收集完毕，记录线虫总数量，计算出每条大蜡螟幼虫产出侵染期线虫的数量（IJs/larva）和每克大蜡螟幼虫产出侵染期线虫的数量（IJs/g）[27]。

1.4 数据统计与分析

本试验涉及的数据分析均使用Excel 2010和SPSS 19.0统计分析软件完成。利用SPSS 19.0 软件中LSD和Duncan’s多重比较法进行差异显著性测定，概率水平为P＜0.05。回归方程及LC50、LT50用Probit模型分析。

2 结果与分析

2.1 线虫JLSY 003分子生物学鉴定

PCR扩增得到的28S rDNA和ITS基因片段大小分别为877和863 bp。分别与GenBank中序列进行比对，构建相应系统进化树并分析，待鉴定线虫JLSY 003的28S序列与O.myriophila种群（AY602176.1）99.88%同源（图1）；ITS序列和O.myriophila种群（MG742125.1）99.06%同源（图2）。由28S rDNA和ITS基因比对结果可知，JLSY 003线虫为O.myriophila品系。

图1 基于D2-D3基因序列构建的JLSY 003系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of JLSY 003 based on D2-D3 sequences data

图2 基于ITS基因序列构建的JLSY 003系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of JLSY 003 based on ITS sequences data

2.2 线虫JLSY 003生物学测定

2.2.1 线虫JLSY 003对大蜡螟末龄幼虫的侵染力测定 结果表明，相同时间下经20～320 IJs/larva的5个不同浓度处理，大蜡螟的死亡率随着线虫浓度的增加而升高。相同浓度下，死亡率随着侵染时间的延长而升高。侵染12、24 h时，80 IJs/larva浓度下的死亡率与160 IJs/larva无显著差异（P＞0.05），但与其他侵染浓度差异显著（P＜0.05）；侵染36 h及以上时，与20、40 IJs/larva差异显著（P＜0.05），与其他两组差异不显著（P＞0.05）。该浓度下侵染48 h的死亡率达到90%，72 h时全部死亡（图3）。上述结果表明，线虫JLSY 003的最适侵染浓度为80 IJs/larva。

24 h时，线虫JLSY 003对大蜡螟的致死中浓度LC50为46.067 IJs/larva；48 h时LC50为25.297 IJs/larva（表1）。线虫JLSY 003浓度为80 IJs/larva时，线虫JLSY 003致死中时间LT50为15.409 h，160 IJs/larva浓度时，LT50为10.334 h（表2）。

表1 24和48 h时JLSY 003对大蜡螟末龄幼虫的致病力测定Table 1 The pathogenicity of JLSY 003 to last instar G.mellonella larvae at the 24 h and 48 h

表2 80和160 IJs/larva条件下JLSY 003对大蜡螟末龄幼虫的致病力测定Table 2 The pathogenicity of JLSY 003 of the 80, 160 IJs/larva to last instar G.mellonella larvae

2.2.2 线虫JLSY 003对高温的耐受性测定 结果表明，相同时间下，随着温度的升高，线虫的死亡率增高。线虫JLSY 003在2 h时难以耐受40 ℃的高温，死亡率高达96.31%，而38 ℃、36 ℃的死亡率分别为8.77%和5.29%。相同温度下，随着处理时间的延长，线虫死亡率增高。当达到一定时间时，死亡率急速增高。在38 ℃条件下，4 h后线虫死亡率快速增加，8 h时死亡率为84.36%。36 ℃条件下，8 h时死亡率为19.27%，64 h内线虫全部死亡。上述结果表明，线虫JLSY 003在36 ℃条件下，至少可耐8 h的高温，死亡率为19.27%（图4）。

图4 JLSY 003在不同温度下的死亡率Fig.4 Mortality rate of JLSY 003 at different temperature

2.2.3 线虫JLSY 003产量测定 在25 ℃下，被线虫JLSY 003（浓度为160 IJs/larva）侵染致死的大蜡螟平均体质量为0.399 g，每条大蜡螟产出的线虫数量为1.873×105IJs/larva，每克大蜡螟所产线虫数量为4.695×105IJs/g。

3 讨论

作为一种重要生物防治技术的EPNs早已被广泛用于防治多种害虫。不同种类EPNs或同一种来自不同地理环境的EPNs之间在抗逆性、繁殖力、侵染力及对不同寄主昆虫的致死力等方面差异很大[28]，筛选出适应当地气候环境条件、综合表现好的线虫种类（品系）对开发利用EPNs尤为重要。

至今为止，有限的几篇有关O.myriophila的报道仅为该线虫的基因学、种类鉴定及对植物病原线虫种群结构的影响[16]，尚缺少有关该线虫的生物学测定报道。本研究表明，在侵染力和侵染时间方面，JLSY 003在80 IJs/larva浓度下具有较高的侵染力，48 h时死亡率为90%，LT50为15.409 h，LC50为25.297 IJs/larva，显著低于相同时间下S.litorale的LC50（153.419 IJs/larva）[29]。24 h时的LC50为46.067 IJs/larva，低于相同时间下O.basothoviin.sp.的 LC50（100 IJs/larva）[6]。

EPNs的侵染力在一定范围内随着温度的升高而增强，超过一定的温度范围后，侵染力和繁殖力快速下降，死亡率增加。明确EPNs的耐温性，有助于正确选择适应当地气候条件的EPN品系。繁殖力和耐热性方面，JLSY 003在36 ℃条件下至少能耐受8 h，水浴4 h时，线虫死亡率仅为8.79%，相同处理下的S.feltiae(TUR-S3)死亡率为100%[30]。在38 ℃、2 h条件下，JLSY 003的死亡率为8.77%，相同处理下H.bacteriophoraXJZL 1409的死亡率高达99.67%[27]。表明JLSY 003在侵染力、繁殖力、致死力、侵染时间及耐高温方面综合表现较好。

本研究中仅用大蜡螟对JLSY 003的侵染力、侵染时间、繁殖力及耐温性方面进行了基础生物学测定，是否具有开发利用价值，尚需进一步对靶标害虫（如天牛、蛴螬、金针虫及地老虎等）进行系统的室内外生物测定和评估。