基于计算机虚拟筛选研究菝葜抗肝癌的作用机制*

邝玉慧，徐方飚，陈晓琦，戴璐璐，谢抗，陈欣菊

1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000； 2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091； 3.广东药科大学中医药研究院，广东 广州 510006

原发性肝癌大多数为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称“肝癌”)，占原发性肝癌85%[1]左右，是全球最常见的消化系统恶性肿瘤，其较高的病死率严重威胁人们的健康和生命。大多数患者确诊时已处于中晚期，失去了手术的机会，而靶向治疗、介入治疗及放化疗的不良反应会进一步加重肝脏负担。中医药是中华民族文化的瑰宝，中医药防治肿瘤有自己独特的特色和优势，在西医治疗手段的基础上加强中医药疗法，不仅能够提高肝癌患者的生存率及生活质量，而且能够减轻放化疗带来的不良反应，增强患者的免疫力。

菝葜为百合科植物菝葜(SmilaxchinaL) 的干燥根茎，又名金刚藤，2015年版《中华人民共和国药典》记载菝葜具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀的功效。现代药理研究发现，菝葜可以抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡，激活巨噬细胞和增强宿主免疫系统功能，临床上也常用于治疗肿瘤的组方中。菝葜具有多成分、多靶点、多途径的相互作用特点，而目前对菝葜的研究多集中针对某一疾病的某一个作用机制，缺乏对其机制系统的研究。

虚拟筛选是利用计算机进行分子对接模拟，帮助筛选小分子药物的一项技术。网络药理学融合了系统生物学、信息网络学和计算机科学，将网络药理学与网络分析相结合，能够系统预测和揭示药物、化学成分、基因、靶点与疾病之间相互关系和作用机制。利用网络药理学和虚拟筛选[2]多层次构建网络模型，是从整体的视角研究中医药，阐释中药有效性和科学性的新方式。因此，本研究通过网络药理学及分子对接技术预测菝葜抗肝癌的潜在作用靶点和通路，明确其作用途径。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件应用中药系统药理学数据库与分析平台(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org)；疾病数据库Genecard(https：//www.genecards.org/)、PharmDB-K数据库(http：//pharmdb.org/)、GAD数据库(https：//geneticassociationdb.nih.gov/)；数据分析软件STRINGR(http：//string-db.org/cgi/input.pl)；基因本体 (gene ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析数据库Bioconductor(http：//www.bioconductor.org/)；Cytoscape3.7.2(插件ClueGO、CluePedia、CytoNCA、MOCODE)、R软件；分子对接模拟软件AutoDockTools；分子结构可视化及对接分析软件Pymol。

1.2 菝葜活性成分与有效靶点的收集利用中药系统药理学分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)数据库，检索“菝葜”的所有化学成分，并根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)值≥30%，类药性(drug likeness，DL)值≥0.18为筛选条件收集主要活性成分，建立药物化学成分数据库，搜索相应的活性成分靶点并查阅近期文献报道，补充未预测到活性成分的已知靶点，然后再通过Uniprot数据库中的UniProKB检索功能(https：//www.uniprot.org/)，通过输入靶蛋白名称，限定物种为“Homo sapiens”，再将得到的靶点蛋白名称转化为基因ID，建立菝葜活性成分靶点数据库。

1.3 肝癌靶点收集与PPI网络的构建检索关键词“hepatocellular carcinoma”，限制物种为“homo sapiens”。对GeneCards、GAD和PharmDB-K数据库收集的肝癌相关靶点基因，建立肝癌靶点数据库。将肝癌靶点数据库与菝葜活性成分靶点数据库对比，提取相同靶基因构建“药物-活性成分-靶点”网络，并上传String平台，限制物种为“homo sapiens”构建蛋白互作网络(protein-protein interaction networks，PPI)。然后导入Cytoscape3.7.2构建网络，并采用CytoNCA对PPI网络进行拓扑分析，得到核心网络。

1.4 肝癌靶点的功能富集分析利用R软件ClusterProfiler包进行富集分析，限定物种为“homo sapiens”，检验值pvalueCutoff≤0.05，qvalueCutoff≤0.05，对关键靶点进行GO生物功能和KEGG富集分析。

1.5 活性成分与关键靶点分子对接根据关键靶点对应的成分，从中筛选出调控靶点最多的成分，通过Pubchem数据库下载小分子化合物结构，采用AutoDock软件去水分子、氢等处理，运用Vina进行分子对接模拟获取对接能量，pymol软件对结果进行分析。

2 结果

2.1 菝葜活性成分与有效靶点的收集本研究通过TCMSP数据库检索到39个活性成分，共295个靶点。并根据DL和BL参数筛选13个有效活性成分并进行靶点预测，去除重复靶点后提取到112个有效靶点，通过Uniport数据库进行基因ID转换。

2.2 肝癌靶点收集通过关键词“hepatocellular carcinoma”在GAD数据库、GeneCards数据库、PharmDB-K数据库检索人的基因，共获得7 525个肝癌相关疾病靶点。然后将所得的肝癌靶标基因与药物有效靶点基因进行对比，映射出11个有效活性成分(见表1)，和53个关键靶点，即为菝葜治疗肝癌潜在的靶标基因。构建“活性成分-靶点”网络(见图1)。

表1 菝葜有效活性成分及对应靶点数

2.3 蛋白互作网络的构建及分析把共同靶标基因导入String软件构建蛋白互作网络PPI(见图2A)。调取得到的蛋白相互作用数据导入Cytoscape3.7.2的插件CytoNCA根据网络药理学研究中评价网络节点重要性的核心参数度值(degree)进行拓扑分析(见图2B)，degree越大，节点越大，颜色越深，说明节点在网络中越接近网络中心位置PPI网络，即有越多的成分作用于该靶点。根据靶蛋白互作网络图中度值大于中位数2倍，即degree≥26为标准，得到7个核心靶点AKT1、VEGFA、CASP3、JUN、HSP90AA1、PPARG、RELA这些靶蛋白与肝癌的发生、转移有关。

注：大红色代表药物菝葜，紫红色代表药物有效活性成分，湖蓝色代表共同基因靶点图1 活性成分-靶点网络图

注：A为蛋白互作网络PPI；B为CytoNCA拓扑分析图2 蛋白互作网络构建与拓朴分析图

2.4 肝癌靶点的功能富集分析对靶点基因进行GO功能富集得到1 792个条目，其中生物学过程(biological process，BP)1 203个条目、细胞定位(cellular component，CC)34个条目、分子功能(molecular function，MF)53个条目。筛选排名前20个条目绘制气泡图(图3A、3B、3C)。生物学过程BP主要表现在对脂多糖的反应、炎症反应、氧化应激的反应、类固醇激素的反应、凋亡信号通路的调节、蛋白磷酸化的正调控、DNA结合转录因子活性等方面。KEGG通路富集分析得到129条信号通路并对前20个条目进行绘图(如图3D)，主要涉及癌症通路、HIF-1信号通路、P53通路、VEGF通路及病毒感染通路等。如表2为前20名显著差异通路及相关基因靶点数，利用Cytoscape构建“通路-靶点”网络(如图4)，靶点所富集的通路越多，则该靶点所代表的长方形形状越大，同理通路所含富集的靶点越多则该通路所代表的六边形形状越大。

注：A：GO-BP；B：GO-CC；图3C-MF；3：D-KEGG通路富集图3 肝癌靶点功能富集分析图

表2 KEGG富集分析前20个相关通路

图4 前20位相关条KEGG靶点-通路图

2.5 活性成分与关键靶点分子对接通过ADME原则筛选的11个活性成分为β-谷甾醇、谷甾醇、山柰酚、伪原薯蓣皂苷、异黄杞苷、黄杞苷、(2R，3S)-2-(3，5-二羟基苯基)色烷-3，5，7-三醇、落新妇苷、紫杉叶素、顺-二氢槲皮素、薯蓣皂苷元。通过TCMSP数据库获取11个活性成分mol2结构，PDB数据库获取7个核心靶点结构，对应PDB ID为：AKT1(ID：6s9w)、VEGFA(ID：1mkk)、CASP3(ID：3v3k)、JUN(ID：5t01)、HSP90AA1(ID：6gr5)、PPARG(ID：6ms7)和RELA(ID：2o61)。利用AutoDock去除蛋白自身配体和去氢、去水分子处理，通过Vina进行配体与分子对接模拟，结合力热图(见图5)。根据以上结果，选择靶点数目靠前的两个活性成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)和山柰酚(Kaempferid)与图4中度值最高的靶点AKT1和CASP9，通过Pymol显示对接结构，β-谷甾醇和山柰酚分别可以稳定地对接到AKT1和CASP9蛋白结构中(见图6)。

图5 分子对接结合力热图

注：A：CASP9与β-谷甾醇；B：CASP9与山柰酚；C：AKT1与β-谷甾醇；D：AKT1与山柰酚图6 分子对接结构图

3 讨论

从TCMSP数据库得到11个活性化学成分和7个核心靶点，菝葜抗肝癌的核心靶点有AKT1、VEGFA、CASP3、JUN、HSP90AA1、PPARG、RELA等；主要是通过抗肿瘤血管生成、抑制肝癌细胞的增殖、促进肝癌细胞的凋亡和调控细胞周期等多靶点、多通路的抗肝癌方式。并根据虚拟筛选，发现11个活性成分与7个核心靶点对接结合能均较好，是菝葜发挥抗肝癌作用的重要化学成分，此外其与7个核心靶点均具有较好的结合能力。若结合能<0 kcal·mol-1，说明配体与受体可以进行自发结合，若结合能<-5.0 kcal·mol-1，说明两者具有较好的结合性。从分子对接热图中可以直观看到，11个活性成分均与7个核心靶点结合能均<-5.0 kcal·mol-1，这说明具有良好的结合力。

进一步研究菝葜抗GO生物过程和KEGG信号通路富集分析发现，菝葜抗肝癌靶点的生物过程涉及对脂多糖的反应、炎症反应、凋亡信号通路的调节、蛋白磷酸化的正调控、DNA结合转录因子活性等方面，这些通路即菝葜重要靶标抗肝癌的主要生物学过程。

本研究通过网络药理学方法筛选出菝葜抗肝癌的主要活性成分β-谷甾醇、山柰酚和薯蓣皂苷元等与临床研究报道[3-4]基本一致。临床药理研究发现，菝葜有抗炎镇痛[5]、抗肿瘤[6]、抗氧化[7]、抑菌[8]、调节免疫体[9]、降血糖[10]等功能。有研究发现，菝葜可能增加PI3K/Akt依赖性eNOS磷酸化内皮细胞中NO的产生与降低VEGF和NOS水平有关，从而诱导血管舒张，抑制肿瘤血管的新生[11-12]。同时菝葜使肿瘤细胞停滞在G2/M期，诱导肿瘤细胞凋亡，可能与激活CASP3，抑制NF-κB和下调Bcl-2和AKT有关[13]。

MAPK14是MAPK家族中的一员，被称为肿瘤抑制因子，与肿瘤和炎症的发生密切相关[14]。热休克蛋白90(HSP90)作为肿瘤蛋白起着调节蛋白质构象，稳定和降解的作用[15]。VEGF是刺激血管生成的主要因子，在多数肿瘤中表达上调。VEGF/VEGFR2通路可能与高表达HSP90AA1/HSPA8患者的HCC复发有关[16]。目前己发现的Caspase(CASP)的家族成员具有传递凋亡信号作用，在维持其致瘤性和转移中起关键作用[17]。AKT是一种苏氨酸蛋白激酶[18-19]，其家族成员主要有3个，分别是AKT1、AKT2和AKT3这3个成员结构类似，激活PI3K/Akt信号通路能够促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

薯蓣皂苷元(diosgenin，DG)除有抗肿瘤外，还具有保肝、抗病毒、抗氧化、抗炎及降血脂等药理活性[20-22]。王华等[23]发现DG能够显著影响丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，从细胞代谢组学方面验证了DG抗肿瘤的作用。DG可能通过抑制对乙酰氨基酚诱导的CYP2E1的活化，上调Bcl-2和Bid的蛋白表达，下调Bax和p53的蛋白表达，减轻对乙酰氨基酚导致的肝毒性[24]。通过抑制STAT3蛋白，进而抑制VEGF表达，抑制血管新生[25]。β-谷甾醇(Beta-Sitosterol，BS)通过细胞周期停滞和凋亡诱导作用在肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌中具有抗肿瘤活性，具有抗癌特性的无毒类化合物[26-27]。研究发现山柰酚下调ERK磷酸化以及NFκB和cMyc表达，上调p21表达，抑制VEGF的分泌，证明其具有抑制血管新生的作用[28]。KF能促进的含氧自由基进而激活磷酸化p53和磷酸化ATM，刺激死亡受体4和死亡受体5，诱导肿瘤细胞凋亡[29]。Yang等[30]研究发现KF抑制MEK/ERK和STAT3信号转导途径，以及激活线粒体凋亡通路，促进肿瘤细胞死亡。张帆等[31]发现KF通过激活凋亡经典通路中的NLRP3和CASP1，从而促进NLRP3炎性小体的组装来诱导HepG2细胞凋亡。KF可能通过下调Bcl-2，并上调Bax、CASP3和CASP9，促进PARP的裂解，下调磷酸化的AKT、TIMP2和MMP2，抑制胃癌(astric cancer，GC)细胞和胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)细胞的增殖[32-33]。这与临床研究发现的通过MAPK、PI3K/AKT、CASP、JAK-STAT等信号通路，抑制肝癌细胞增殖和凋亡，以及通过PI3K/AKT通路促进肝癌细胞自噬基本一致[34-35]。

综上所述，本研究中所预测的菝葜主要活性成分及抗肝癌靶点与临床结果基本一致。随着网络药理学与分子生物学等发展，中药抗肝癌机制研究已深入分子基因层面。目前临床关于菝葜中有效活性成分及作用机制的研究与本研究所预测结果基本一致。本研究初步分析了菝葜抗肝癌的活性成分及相关的信号通路和生物过程，为菝葜抗肝癌的药理活性、靶点研究及作用机制提供了一定的理论支持，为以后药理实验的研究提供了方向。肝癌的发生与发展涉及多个基因和多个通络，然而肝癌细胞信号通路复杂，一些菝葜活性成分及其作用机制尚未进行深入研究，因此可以在本研究的基础上进一步研究菝葜抗肝癌的分子作用机制。