苍防汤对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎保护作用研究*

李登云，颜国华，曹世霞，陈文霞，赵新永

郑州工业应用技术学院，河南 郑州 451100

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性、复发性强的胃肠道功能紊乱性疾病，属于炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)范畴。该病主要发生在结肠黏膜且病变多从结肠远端发展，主要临床表现以腹泻、血便、黏液脓血便以及体质量减轻为主，重症患者伴有高热及中毒症状。本病反复发作、迁延难愈，严重影响患者生活质量[1-2]。流行病学调查显示，溃疡性结肠炎在欧美等国家较为常见，我国近年来的发病率也呈显著上升趋势。我国溃疡性结肠炎的年患病率已达到2/10 000，与八十年代相比提高6倍[3-4]。现代研究认为，该病的发生是由带有易感基因和肠道内菌群相互作用导致的，这些易感基因都与免疫系统有关。遗传易感者的致病因素会激活免疫系统引发炎症反应，中性粒细胞、单核-巨噬细胞及T淋巴细胞参与UC发生发展的不同阶段，它们释放的各种炎症因子如白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是公认的介导UC的促炎因子[5]，这些炎性因子均可引起结肠黏膜的损害，导致UC的发生[6]。正常情况下肠道黏膜表面与肠道管腔之间存在一道天然免疫屏障——黏液屏障，对肠黏膜起到保护作用。构成结肠组织黏液屏障的主要成分是杯状细胞分泌的一种黏蛋白(mucins，MUC)，其中MUC2是结直肠中最主要的分泌型黏蛋白，也是结肠黏液层中最主要的成分，对炎症性肠病的发生、发展和愈合起重要作用[7]。

临床上用于治疗UC的药物主要包括氨基水杨酸类、免疫抑制剂类、糖皮质激素类及微生态制剂等[8]。这些药物在治疗UC中都起到了很好的治疗作用，但是它们的不良反应时有报道[9-10]。因此，寻找新的治疗作用显著且副作用小的药物迫在眉睫。

中医认为，UC属于中医上“肠澼”“痢疾”“飨泄”以及“小肠泄”等范畴，基本病机为湿热蕴肠、气滞络瘀，病位主要在大肠，发病基础为脾虚失健。苍防汤出自《素问病机气宜保命集》，“苍术去皮，四两，麻黄去根节，四两，防风去芦头，五钱。上为粗末，每服一两，生姜七片，水二盏，煎至一盏，去滓温服”。该方全称苍术防风汤，原为治“飨泄”而设，主治脾失健运而致飧泄、完谷不化之症，现在多用于痢疾、痹证等风寒湿阻型病症，在原方中加入白术增强其健脾祛湿的效果。目前，关于苍防汤在治疗UC的疗效以及机理方面还未见公开报道。因此，本研究通过DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型，来阐明苍防汤治疗UC的作用及其机理，为临床治疗UC提供现代分子生物学基础。

1 材料

1.1 动物12周龄SPF级SD雄性大鼠100只，体质量300～350 g，购于郑州大学实验动物中心，合格证号：SCXK(豫)2010-0002。饲养条件：温度(22±2) ℃，湿度(45±10)%，光/暗循环12 h/12 h。郑州工业应用技术学院伦理委员会批准本研究涉及的动物实验，编号：2020-010。

1.2 药物与试剂柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP，上海信宜制药公司，批号：H31020668)；葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS，上海翊圣生物科技有限公司，货号：60316ES25)；HE染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，货号：C0105)；Cleaved caspase-3、MUC2抗体(CST公司，货号：9664、3033S)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、硝酸纤维素膜(北京索莱宝科技有限公司，货号：PC0020、YA1711)；兔二步法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：PV9001、ZLI 9018)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技术有限公司，货号A0208)；Trizol(美国Invirogen公司，货号：15596026)；荧光PCR试剂盒(美国Taqman公司，批号：A15869)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 仪器CX21型生物显微镜(日本Olympus Corporation公司)；DYC-Mini1型垂直蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；FD-1C-80型冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司)；Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；H2500R-2型低温高速离心机(离心半径：22.5 cm，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；GelDoc EZ型免疫印迹分析仪(美国Bio-Rad公司)；752N型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；7500型荧光PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 药物制备取苍术180 g，防风 150 g，麻黄 60 g，白术150 g，生姜90 g。去离子水覆盖药材，浸泡并常规煎煮，80目过滤网过滤，收集滤液，其剩余药材加入适量去离子水再次煎煮。合并两次所得滤液，通过冷冻干燥制成冻干粉备用。所有中药材均购于亳州市中药材市场。

2.2 动物模型100只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性组、苍防汤低、高剂量组，每组20只。大鼠饥饿12 h后(断食不断水)，恢复正常饮食，并给予5.0%的DSS无菌水溶液，连续5 d，建立UC模型[11-12]，正常组大鼠正常饮水。第6天，大鼠出现腹泻、大便出血、体质量明显下降等症状，停止DSS饮水，给予大鼠正常饮水并灌胃给药，阳性组大鼠给予0.67 g·kg-1SASP，苍防汤低、高剂量组分别给予1.0 g·kg-1和10.0 g·kg-1的苍防汤冻干粉溶液，正常组大鼠给予等体积的生理盐水，每天1次，连续治疗2周。

2.3 一般指标检测用药开始后，每天测量大鼠体质量、观察粪便及便血情况，根据观察情况计算疾病活动指数(disease activity index，DAI)。体质量下降：<1%计0分，1%～5%计1分，6%～10%计2分，11%～15%计3分，>15%计4分；便血：阴性计0分，阳性计2分，严重出血计4分；粪便形成：正常计0分，便溏计2分，腹泻计4分。实验结束后，切除其结肠，并根据Minaiyan等[13]的研究在显微镜下观察结肠组织创面大小和炎症程度并计分。溃疡创面：无溃疡计0分，<3 mm计1分，>3 mm计2分；炎症计分：无炎症计0分，轻度炎症计1分，重度炎症计2分。根据结肠组织溃疡创面计分和炎症计分，计算肠黏膜损伤指数。损伤程度评分：未损伤黏膜层计0分；损伤黏膜下层计1分；损伤黏膜肌层计2分；损伤浆膜层计3分。

2.4 HE染色观察结肠组织病理变化4%多聚甲醛固定结肠组织，95%乙醇脱水，石蜡包埋，切成 5 μm 厚切片，脱蜡，蒸馏水清洗，苏木精染色1 min，盐酸乙醇分化3 s，蒸馏水冲洗，氨水返蓝，伊红素复染2 min，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，封片，置显微镜下观察。

2.5 免疫组化检测结肠组织细胞凋亡情况严格按照试剂盒说明操作：切片常规处理后，用pH 6.0、10 mmol·L-1柠檬酸钠缓冲溶液高压锅内蒸煮 15 min 进行抗原修复，3%H2O2封闭10 min，清洗，5% BSA封闭，加入一抗(11 500)，4 ℃过夜，PBS清洗，室温下加入二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色 5 min，盐酸乙醇分化，复染，梯度脱水，二甲苯透明并封片，显微镜下观察。

2.6 定量PCR检测结肠组织中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ及MUC2的mRNA水平每组取1 g结肠组织，匀浆，用Trizol试剂提取总RNA，逆转录成cDNA。PCR反应体系：上下游引物各0.5 μL，5×PCR buffer 10 μL，dNTPs 0.5 μL，Tap酶1 μL，cDNA模板5 μL，补加双蒸水至50 μL。扩增条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40个循环。实验以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法 计算目的mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot 检测MUC2蛋白的表达水平取15mg新鲜结肠组织于1.5 mL试管内，加入含100 nmol·L-1蛋白酶抑制剂的 RIPA组织裂解液300 μL，用超声粉碎仪打碎混匀，13 000 rpm·min-1离心15 min，吸取上清液，用BCA测定试剂盒测定总蛋白含量。取50 μg蛋白用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至于硝酸纤维素膜，PBS洗3次，5%BSA室温封闭1.5 h，分别加入MUC2(11 500)及β-actin(12 000)一抗，4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次，加入HRP标记的山羊抗兔二抗(15 000)，室温孵育1.5 h，Pierce ECL Plus发光液显影，每组独立灰度扫描3次，以β-actin为内参蛋白，分析目的蛋白条带灰度值[14]。

3 结果

3.1 苍防汤对大鼠疾病活动指数、肠黏膜损伤指数及损伤程度评分的影响与正常组相比，模型组大鼠DAI、肠黏膜损伤指数及损伤程度评分均显著增加(P<0.05)；与模型组相比，苍防汤低、高剂量组大鼠DAI、损伤指数及损伤程度评分均明显降低(P<0.05)。提示苍防汤可明显减轻溃疡性结肠炎的结肠损伤程度。见表2。

表2 苍防汤对溃疡性结肠炎大鼠DAI、肠黏膜损伤指数及损伤程度评分的影响

3.2 苍防汤对结肠形态学的影响与正常组大鼠结肠组织相比，模型组大鼠结肠组织中出现明显的溃疡和炎症，组织结构被破坏，可见大量深染的白细胞和淋巴细胞；与模型组相比，苍防汤组大部分上皮细胞和隐窝损伤被修复，结构趋于恢复正常，炎症浸润基本消失。提示苍防汤能够抑制结肠炎症，减轻结肠组织损伤。见图1(箭头所指为损伤处)。

3.3 苍防汤对结肠细胞凋亡的影响与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中阳性细胞较多(染色为深褐色，黄色箭头所指)；与模型组相比，苍防汤组阳性标记的细胞显著减少，几乎观察不到。表明苍防汤可以剂量依赖性地降低DSS诱导的结肠细胞凋亡。见图2。

注：A：正常组；B：模型组；C：阳性组；D：苍防汤低剂量组；E：苍防汤高剂量组图1 苍防汤对结肠形态学的影响(HE染色，×100)

注：A：正常组；B：模型组；C：阳性组；D：苍防汤低剂量组；E：苍防汤高剂量组图2 苍防汤对结肠细胞凋亡的影响(×100)

3.4 苍防汤对结肠中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ及MUC2mRNA表达水平的影响与模型组相比，苍防汤低、高剂量组均能显著降低结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表达水平(P<0.05)，显著升高IL-10及MUC2的mRNA表达水平(P<0.05)，其中高剂量苍防汤的作用更为明显。表明苍防汤可剂量依赖性地改善炎症相关因子及MUC2的mRNA表达。见表3。

表3 苍防汤对结肠组织中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和MUC2 mRNA表达水平的影响

3.5 苍防汤对结肠组织中MUC2蛋白表达的影响与模型组比较，苍防汤显著升高结肠组织中MUC2的蛋白表达量(P<0.01)。结果见图3，表4。

注：A：正常组；B：模型组；C：阳性组；D：苍防汤低剂量组；E：苍防汤高剂量组图3 苍防汤对结肠组织中MUC2蛋白表达的影响

表4 苍防汤对结肠组织中MUC2蛋白表达的影响

4 讨论

溃疡性结肠炎是一种慢性炎症性肠病，虽然对其进行了大量研究，但目前其发病机制还不清楚[15]。这种疾病往往迁延不愈，而临床中那些难治的、症状严重的患者，有时须通过手术来治疗[16]，但手术存在损伤大、易复发等问题。因此，探索其他新的治疗方式，对于其临床治疗具有重要意义。中药作为传统药物，在治疗UC上显示出良好效果[17-18]。苍防汤具有解散风邪、通行滞气、健脾燥湿之功效，常用于治疗“飨泄”。本研究通过复制溃疡性结肠模型，探索苍防汤对其的治疗效果，结果发现苍防汤可显著减轻模型大鼠的症状，提示苍防汤治疗UC 的有效性。

结肠环境在溃疡性结肠炎的进程中扮演着重要的角色。在UC患者和DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型中，结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6 及IFN-γ的水平显著高于正常组，而IL-10和MUC2的水平显著降低[19-20]。在DSS诱导的大鼠模型中，当阻断大鼠表达IL-6时，T细胞和B细胞活化钝化，肠道炎症相应减少，可抑制UC的发展[21-22]。研究表明，有效抑制结肠组织中TNF-α或其他相应炎症因子的释放都可以对溃疡性结肠炎患者起到治疗作用[21，23]。研究发现，对UC有效的药物大多能够促进MUC2蛋白的表达和分泌，而MUC2的表达和分泌可改善病人的相应症状[24]。

本研究发现，给予苍防汤后，大鼠结肠组织中的炎症反应显著减轻，细胞凋亡减少，说明炎症损伤得到有效抑制。对结肠组织中炎症因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平检测发现，苍防汤能显著降低促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ表达水平，升高抑炎因子IL-10的表达，增加黏膜屏障蛋白MUC2的表达，这与我们前期研究结果一致[12]。现代药理学研究也发现，苍防汤配方中的某些单味药对炎症性疾病有良好的作用，如苍术可通过抑制胃组织中TNF-α、IL-6、IL-1的mRNA的表达水平，降低血液中TNF-α、IL-6、IL-1 的含量，达到治疗胃溃疡的作用[25-26]；防风可以抑制COX-2的活性，从而降低TNF-α、IL-1和IL-6的分泌，减轻大鼠风湿性关节炎和肌痉挛[27]；麻黄可抑制肺部炎症细胞的浸润及TNF-α、IL-6、IFN-γ的分泌，减轻香烟诱发肺部炎症反应[28]。这些单味中药在不同的炎症疾病中，在一定程度上可通过调节炎症介质而抑制炎症反应。

综上，苍防汤可明显改善DSS诱导的溃疡性结肠炎，其作用机理可能是抑制炎症介质的表达，促进保护性黏蛋白的增加，从而减轻结肠炎症反应，降低结肠组织损害。