基于Wnt/β-catenin通路研究麝香保心丸对冠心病心力衰竭大鼠的作用*

黄菲菲，王辉，高翔，黄仲略，苏华俊，曹建雷

1.武汉市蔡甸区人民医院，湖北 武汉 430100； 2.武汉大学中南医院，湖北 武汉 430000

心力衰竭是指心脏舒张或收缩功能障碍，不能充分排出静脉回心血量，导致动脉血液灌注不足，静脉血液淤积，继而引发心脏循环障碍。心力衰竭不是一种独立的疾病，而是各类心脏疾病发展的终末阶段。心肌重构是心力衰竭的重要病理机制，主要表现有心肌纤维化、心腔扩大、心肌肥厚等[1-2]。研究表明，心力衰竭发生时会伴随心肌细胞凋亡，该症状与心肌细胞氧化应激损伤、线粒体功能障碍有密切关联[3-5]。心肌细胞的氧化应激反应越强，机体抗氧化能力越弱，氧化还原失衡就越严重。线粒体功能障碍可能导致氧化磷酸化不足，从而增加氧化应激中间产物，加强对心肌细胞的损害，其动力学平衡机制可能与Wnt/β-catenin通路相关[6]。因此，探索心肌损伤发生的主要机制并研究保护心脏功能的相关药物一直是临床研究的一项重要课题。麝香保心丸是心内科临床常用药物，具有改善冠状动脉血流量，减轻心肌纤维化等功效，同时可以强心益气，改善患者的心功能[7]，但具体作用机制尚不明确。本研究旨在观察麝香保心丸对冠状动脉粥样硬化性心脏病心力衰竭心肌损伤、心肌细胞氧化应激的影响，并探究其作用机制。

1 材料

1.1 动物90只健康雄性SD大鼠，体质量240～260 g，购自成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SYXK(川)2014-189。饲养于室温22～24 ℃，相对湿度50%，自然光照，自由饮水。

1.2 药物与试剂麝香保心丸(上海和黄药业有限公司，批号：101435)；卡托普利片(石家庄科迪药业有限公司，批号：2015526)。脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)试剂盒(上海奥陆生物科技有限公司，批号：F8185-A)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，货号：SNM536-VFE)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司，货号：JKSJ-1834)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司，货号：JKSJ-1892)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司，货号：JKSJ-1821)；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司，货号：JK-2396)；PrimeScriptTM RT reagent Kit(日本TaKaRa，批号：RR420A)；戊巴比妥钠(上海紫一试剂厂，货号：57-33-0)；40 ng·L-1多聚甲醛(西安百萤生物科技有限公司，货号：20010)；蛋白酶K(美国 Sigma-Aldrich公司，货号：3450-01-6)。

1.3 仪器ALC-V8S型小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)；FX7202型心电图机(日本福田)；Vevo2011型小动物超声实时影像系统(加拿大Visual Sonics公司)；ES-2型紫外分光光度仪(日本Malcom公司)；LightCycler 2.0型PCR仪(罗氏设备有限公司)；DM3000型光学显微镜(德国Leica公司)。

2 方法

2.1 大鼠造模与分组大鼠适应性喂养1周，随机选择15只大鼠为假手术组，其余75只大鼠复制心力衰竭模型。腹腔注射3%戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)对大鼠进行麻醉，将其仰卧位固定在手术台上，在大鼠颈部做一切口进行插管并连接动物呼吸机，四肢皮下插入动物机能电极，进行心电监测，然后结扎左冠状动脉前降支，心电图显示T波增高甚至与QRS波融合视为造模成功[8-9]。假手术组仅切开胸膛，但不结扎左冠状动脉前降支。造模4周后对大鼠进行分组，剔除造模失败大鼠，各组均保留14只，随机分为卡托普利(135 mg·kg-1)组、麝香保心丸(低、中、高剂量)(25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、75 mg·kg-1)组与模型组。假手术组、模型组用相应体积的生理盐水进行灌胃，每日1次，连续治疗4周。

2.2 观察指标

2.2.1 心脏形态学的检测采用小动物超声实时影像系统检测大鼠心脏体积变化情况。将大鼠固定在解剖台上并用异氟烷进行麻醉，对大鼠进行心脏定位，并通过M模式超声评价大鼠心脏功能。检测大鼠左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension，LVDs)、左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume，LVESV)，所有数据均选取3个测量值的平均值。

2.2.2 血浆BNP水平的检测每组随机选择10只大鼠，用含EDTA的抗凝管进行腹主动脉取血，静置30 min后，离心(3 500 r·min-1，10 min)，取上清，采用放射免疫法检测血浆BNP水平。

2.2.3 心脏质量指数(total heart mass index，HWI)的测定取血后，打开大鼠腹腔，摘取大鼠心脏，并用滤纸吸干水分，称取心脏质量(heart mass，HM)，并计算HWI[HWI=HM/体质量(body mass，BM)]。

2.2.4 心肌病理组织学变化每组随机选择3只大鼠，取心脏，浸入40 ng·L-1多聚甲醛溶液中，24 h 后按常规方法进行脱水，脱水处理后用石蜡包埋，切片(厚度约5 μm)；放置于二甲苯溶液中浸泡10 min，取出，再次更换二甲苯浸泡 10 min，取出，放置于50%二甲苯浸泡5 min，将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟，酸水及氨水中分色10 s，流水冲洗1 h后入蒸馏水片刻，70%和90%乙醇中脱水各10 min，入伊红染色液染色 2 min，经100%乙醇脱水，再经二甲苯使切片透明，并镜检拍照。

2.2.5 心肌细胞凋亡指数的检测将上述HE染色的蜡块，采用TUNEL法按照试剂盒说明书执行各项操作。切片滴加20 ng·L-1蛋白酶K，20 min后，用PBS(pH7.4)洗3次，每次5 min，加3%小牛血清白蛋白和20%小牛血清，15 min后，滴加反应液 50 μL，置湿盒内，37 ℃放置1 h，加0.01 mol·L-10.3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，采用PBS(pH7.4)洗3次，每次5min，加3%小牛血清白蛋白、1%封阻剂和20%小牛血清孵育15 min，滴加 12稀释的POD(HRP连结的抗荧光素抗体) 20 μL孵育30 min，采用PBS(pH 7.4)洗3次，每次 5 min，镜检细胞核棕褐色即为阳性，每个标本镜检5张切片，AI=凋亡细胞核/总细胞核数。

2.2.6 心肌细胞氧化应激指标的检测ROS检测：①将大鼠(假手术组、模型组、卡托普利组、麝香保心丸低剂量组、麝香保心丸中剂量组、麝香保心丸高剂量组，每组8只)部分心肌组织剪碎，并用PBS漂洗。之后加入消化酶，在37 ℃恒温水浴锅中水浴加热 20 min，300目过筛，离心(离心半径8 cm，3 000 r·min-1，5 min)，PBS漂洗2次，制备单细胞悬液，加入DCFH-DA稀释液(100 μL，1500)，37 ℃ 孵育 1 h，PBS漂洗；通过化学荧光法检测ROS。②MDA、SOD、GSH-Px检测：取上述各组大鼠部分心肌细胞剪碎，加入PMSF混合液与Lysis buffer(800 μL)，离心(离心半径8 cm，12 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，取上清液BCA定量，并通过Excel绘制标准曲线计算蛋白浓度，MDA、SOD、GSH-Px检测步骤参考试剂盒说明书。

2.2.7 Wnt/β-catenin通路相关基因水平的检测每组随机选择3只大鼠，取心脏，通过Trizol法提取RNA，沉降、洗涤、重悬后反转录cDNA，采用紫外分光光度计检测RNA含量。扩增体系20 μL，预变性95 ℃30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s，延伸95 ℃ 15 s，循环40次。LRP6引物：上游5′-CGTCTACTGGACGGACGATG-3′，下游5′-GGTCCCATTGAGCCTTGTCA-3′，长度187 bp；GSK-3β上游 5′-GGGACAGTGGTGTGGATCA-3′，下游5′-GCCGAAAGACCTTCGTCCAA-3′，长度144 bp；3β-catenin上游5′-ATCATTCTGGCCAGTGGTGG-3′，下游5′-GACAGCACCTTCAGCACTCT-3′，长度104 bp。每个样本3个复孔，并通过2-△△CT法计算其表达量。

3 结果

3.1 大鼠心脏超声心动图的测定与假手术组比较，模型组大鼠LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，麝香保心丸组低、中、高剂量组及卡托普利组大鼠LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV均明显下降(P<0.05，P<0.01)。见表1、图1。

表1 各组大鼠心脏超声心动图结果比较

注：假手术组；B：模型组；C：卡托普利组；D：麝香保心丸低剂量组；E：麝香保心丸中剂量组；F：麝香保心丸高剂量组图1 各组大鼠心脏超声心动图

3.2 大鼠血浆BNP水平的测定与假手术组比较，模型组大鼠血浆BNP水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，麝香保心丸低、中、高剂量组及卡托普利组大鼠血浆BNP水平显著下降(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血浆BNP水平比较

3.3 大鼠心脏质量指数的测定与假手术组比较，模型组大鼠HWI、LVMI均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，麝香保心丸低、中、高剂量组及卡托普利组大鼠HWI、LVMI均显著下降(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠心脏质量指数比较

3.4 大鼠心肌细胞HE染色及心肌细胞凋亡指数的测定假手术组大鼠心肌细胞排列整齐、结构规则，心肌纤维完整，未出现变形坏死；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱、形态各异，部分心肌纤维变形；麝香保心丸低、中、高剂量组及卡托普利组大鼠心肌细胞受损程度明显低于模型组，心肌细胞排列较为整齐。见图2。

与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞AI显著升高(P<0.01)；与模型组比较，麝香保心丸低、中、高剂量组及卡托普利组大鼠心肌细胞AI显著下降(P<0.01)。见图3、表4。

表4 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较

注：假手术组；B：模型组；C：卡托普利组；D：麝香保心丸低剂量组；E：麝香保心丸中剂量组；F：麝香保心丸高剂量组图2 大鼠心肌细胞病理学结果(HE，×200)

注：假手术组；B：模型组；C：卡托普利组；D：麝香保心丸低剂量组；E：麝香保心丸中剂量组；F：麝香保心丸高剂量组图3 大鼠心肌细胞凋亡(×200)

3.5 大鼠心肌组织氧化应激指标的测定与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织ROS、MDA水平显著升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px水平显著下降(P<0.01)；与模型组比较，麝香保心丸低、中、高剂量组及卡托普利组大鼠心肌组织ROS、MDA水平均显著降低(P<0.01)，SOD、GSH-Px水平均显著升高(P<0.01)。见图4、表5。

表5 各组大鼠心肌细胞氧化应激指标比较

3.6 对大鼠心肌组织LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平的影响与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，麝香保心丸低、中、高剂量组及卡托普利组大鼠心肌组织LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平均显著降低(P<0.01)。见表6。

表6 对大鼠LRP6 mRNA、GSK-3β mRNA、3β-catenin mRNA水平的影响

注：A：假手术组；B：模型组；C：卡托普利组；D：麝香保心丸低剂量组；E：麝香保心丸中剂量组；F：麝香保心丸高剂量组图4 大鼠心肌细胞ROS流式图

4 讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病心力衰竭是临床常见的心血管疾病，患者的心输出量下降导致机体静脉回流不畅[10-12]。在心力衰竭疾病进程中，心肌结构的改变是导致疾病恶化的关键因素。抑制、缓解心室重构是治疗心力衰竭的关键所在[13-14]。中医药在冠状动脉粥样硬化性心脏病心力衰竭中运用较为广泛，麝香保心丸是由《太平惠民和剂局方》中的苏合香丸衍生而来的中成药，在临床中应用十分广泛，主要用于治疗心功能不全、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心脑血管疾病[15]。研究发现，麝香保心丸具有改善心肌重构、扩张冠状动脉、减轻心肌纤维化、改善冠状动脉血管痉挛、促进缺血心肌局部微循环、保护血管内皮细胞等[16]。

心脏等重要靶器官缺氧缺血会造成能量代谢紊乱，机体可通过中性粒细胞呼吸爆发、产生黄嘌呤氧化酶的途径产生大量氧自由基[17-18]。机体抗氧化能力下降，导致心肌细胞等长期处于氧化应激状态。自由基会加重对心脏的损伤并促进心肌纤维化进程，引发心室重构，进一步加重心功能障碍，发展为心力衰竭。有研究指出，β-catenin敲除可抑制心肌、细胞分化、防止心室重构，有利于改善心力衰竭患者的预后[19]。此外，Wnt也是驱动组织形态与结构变化的关键因素。提示心室重构与Wnt/β-catenin通路有密切关联[20]。研究表明，Wnt/β-catenin通路与线粒体力学间关系密切，LRP6作为其中的关键纽带，可激活分裂蛋白Drp1造成线粒体功能障碍，导致心功能不全、致死性扩张型心肌病等[21-22]。GSK-3β可作用于众多转录因子与信号蛋白结构蛋白，在细胞中过度活化，促进细胞凋亡[23-24]。

本研究表明，麝香保心丸组可显著降低大鼠血浆BNP水平。BNP是重要的神经激素，可反映心室扩张程度，BNP水平上升可增加心排出量以维持血容量的稳定，加重心力衰竭程度[25-26]。LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV可有效反映大鼠的心脏结构，是判断大鼠心室重构程度的有效观察指标，结合心脏质量指数、超声心动图及心肌组织病理学检查结果可知，麝香保心丸可有效抑制心室重构、减轻大鼠心肌纤维化程度、抑制心肌细胞凋亡。细胞凋亡是导致心力衰竭进一步恶化的关键因素，其发生机制可能与氧化应激、线粒体损伤有关[27-28]。当心肌细胞缺氧缺血之后，氧化应激水平能力明显降低，导致ROS大量堆积，不饱和脂肪酸转化为脂质过氧化物，中间产物MDA水平升高，机体氧化-抗氧化系统失衡，导致氧化应激反应扩散与心肌损伤。SOD与GSH-Px能够将自由基转变为无毒物质，减轻机体的氧化应激反应[29-30]。本研究发现，麝香保心丸可显著减轻大鼠心肌细胞氧化应激反应，保护心肌细胞组织。同时，也可降低心肌组织LRP6mRNA、GSK-3βmRNA、3β-cateninmRNA水平，从而抑制心肌重构、减少细胞凋亡、保护线粒体功能。麝香保心丸在冠状动脉粥样硬化性心脏病心力衰竭大鼠的治疗不亚于卡托普利片的治疗效果。

综上所述，麝香保心丸可有效缓解冠状动脉粥样硬化性心脏病心力衰竭大鼠心室重构进程，减轻心肌细胞氧化应激反应，抑制心肌细胞凋亡，改善大鼠心功能，可能通过抑制Wnt/β-catenin通路有关，其治疗效果显著，值得进行推广应用。