DPA体外抗炎活性及机制研究

郑振霄，朱 凯，戴志远*

（1浙江工商大学海洋食品研究院 杭州 310012 2浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州 310012）3 浙江工商大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 杭州 310012）

炎症是活体组织对有害刺激的一种保护性生理反应，通常情况下，炎症反应是为了清除有害刺激并促进伤口愈合。然而，持续的炎症反应会损伤机体[1-3]。由于快节奏的生活方式，导致出现更多不健康的饮食方式和不规律的作息时间，使人们体内发生炎症的概率大幅增加。如果炎症得不到有效控制，很容易引发癌症、心血管疾病和代谢疾病等恶性疾病，严重影响人们的生活质量[4-7]。目前，市面上用于消炎的多数为西药制剂，这些制剂虽具有一定的消炎作用，但副作用、耐药性等问题不容忽视。

近年来，随着人们对n-3 多不饱和脂肪酸（n-3PUFA）研究的不断深入，发现n-3PUFA【主要指二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）、二十二碳六烯酸（DHA）】之所以对人体产生有益作用，与它们具有的抗炎作用是分不开的。此外，n-3PUFA 是天然存在于自然界中的物质，长期服用几乎不会对人体产生毒副作用，因此，对n-3PUFA 抗炎活性及机制的研究成为热点[8]。目前，相关研究主要集中在EPA 和DHA 上，对DPA 相关活性及机制的研究非常少。这主要是因为DPA 与EPA 和DHA 的结构性质相似，难以获得DPA 纯品。二十二碳五烯酸（DPA）是α-亚麻酸（ALA）经过碳链加长酶、去饱和酶和β-氧化代谢而成，存在于金枪鱼、三文鱼等深海鱼类及海豹、海狗等海洋哺乳动物中，含量一般在2%～7%，此外在动物瘦肉、牛乳中也有少量分布[9]。

本文以脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7 为炎症的体外模型，采用本实验室自制的DPA 纯品对其进行干预，通过炎症介质和炎症因子评价DPA的抗炎能力，并从NF-κB 代谢通路的角度探索DPA 体外抗炎活性机制，旨在为DPA 后续的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

DPA 乙酯（纯度>97%）由本实验室自制，制备方法参考文献[10]；RAW264.7 细胞，中科院上海生命科学研究院（110642）；DMEM 高糖培养基，海克隆生物化学制品（北京）有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 试剂盒，美国R&D 公司。

1.2 试剂

LPS（分析纯），北京索莱宝科技有限公司；95%乙醇（分析纯），杭州双林化工试剂厂；异丙醇（分析纯）、氯仿（分析纯），国药集团（上海）有限公司。

1.3 仪器与设备

恒温CO2细胞培养箱（E163302）、台式低温高速离心机（Micro17R），美国Thermo Fisher Scientific 公司；恒温水浴锅（DKS-12），上海森信实验仪器有限公司；净化生物超净工作台（YJ-840），苏州净化设备有限公司；倒置显微镜（TS2），日本尼康株式会社；PCR 仪（T100）、荧光定量PCR 仪（CFX96），美国Bio-Rad 公司。

1.4 方法

细胞培养和干预：RAW264.7 细胞培养在细胞培养液中（含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基），并置于细胞培养箱中（37 ℃，5%CO2），每2 d传代1 次。

n-3PUFA 工作液的制备：用乙醇将EPA、DPA和DHA 溶解，配制成20 mmol/L 的母液，之后取适量母液，加到细胞培养液中制得60 μmol/L 的EPA、DPA 和DHA 工作液。

试验分组：1）细胞培养在含有0.8 μg/mL LPS和60 μmol/L EPA 的细胞培养液中24 h（EPA组）；2）细胞培养在含有0.8 μg/mL LPS 和60 μmol/L DPA 的细胞培养液中24 h（DPA 组）；3）细胞培养在含有0.8 μg/mL LPS 和60 μmol/L DHA的细胞培养液中24 h（DHA 组）；4）细胞培养在含有0.8 μg/mL LPS 的细胞培养液中24 h（LPS 组）；5）细胞培养在细胞培养液中24 h（对照组）；LPS、EPA、DPA 和DHA 的作用浓度由前期的MTT 实验确定。

NO 测定采用Griess 法；PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 分泌量的测定参照试剂盒上的说明书进行。TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 表达量的测定采用RT-qPCR 方法。Western blot 检测由谷歌生物科技有限公司完成。

1.5 数据统计分析

相关测定数据均以“平均值±标准偏差”表示。采用SPSS 21.0 软件对数据进行显著性分析，采用Origin 9.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 DPA 对NO 分泌和iNOS 表达的影响

NO 是机体内广泛存在的气态内源性信号分子，在免疫反应中发挥了重要的调控作用，NO 在正常细胞内的含量很少，炎症会诱导细胞合成较多的一氧化氮合酶（iNOS），产生大量的NO[11]。不同处理条件下细胞分泌的NO 的量如图1a 所示，NO 在LPS 组中的分泌量最高，EPA、DPA 和DHA干预能够显著降低NO 的分泌量。以LPS 组NO的分泌量为100%，EPA、DPA 和DHA 处理后，NO的分泌量分别下降到46.63%，23.95%和24.81%，这说明DPA 和DHA 比EPA 更能够抑制NO 的分泌。对照组中NO 的分泌量最低，仅为LPS 组的5.16%。由于NO 是由iNOS 诱导产生，不同分组中iNOS 的表达水平通过Western blot 方法检测，结果如图1b 所示，结果与NO 分泌量结果相似。

图1 DPA 对NO 产量及iNOS 表达的影响Fig.1 Effect of DPA on the production of NO and expression of iNOS

2.2 DPA 对PGE2 分泌和COX-2 表达的影响

PGE2 是类花生酸中的重要成员，对炎症的发生和发展具有很强的诱导作用，可以间接反映体内炎症反应的强度，由花生四烯酸在环氧合酶-2（COX-2）催化下生成[12-13]。不同处理对细胞中PGE2 分泌的影响如图2a 所示。LPS 组中PGE2的分泌量最高，EPA、DPA 和DHA 处理后PGE2的分泌量均有显著下降。以LPS 组中的分泌量为100%，EPA、DPA 和DHA 处理后，PGE2 的分泌量分别下降到52.24%，38.18%和42.31%，这说明DPA 抑制PGE2 分泌的能力最强，DHA 次之，EPA最弱。不同处理对细胞中COX-2 表达的影响如图2b 所示，结果与PGE2 结果具有一致性。

图2 DPA 对PGE2 产量及COX-2 表达的影响Fig.2 Effect of DPA on the production of PGE2 and expression of COX-2

2.3 DPA 对炎症因子分泌量的影响

不同处理条件对细胞中炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10）分泌的影响如图3所示。对于TNF-α，LPS 组中的分泌量最高，EPA、DPA 和DHA 处理后，细胞中TNF-α 的分泌量均有下降，其中DPA 和DHA 的抑制作用强于EPA，而两者之间没有显著差异（P<0.05）。IL-1β 在LPS 组中的分泌量最高，EPA、DPA 和DHA 处理均可以有效抑制其分泌，其中DPA 的抑制能力最强，DHA 次之，EPA 较弱。IL-6 在LPS 组中的分泌量也最高，EPA、DPA 和DHA 处理均可以显著抑制其分泌，而三者之间无显著差异（P<0.05）。对于抗炎因子IL-10 来讲，其分泌量在LPS 组中最低，EPA、DPA和DHA 处理组中的分泌量显著高于LPS 组，其中DPA 组的含量要显著高于EPA 和DHA 组。

图3 DPA 对炎症因子产量的影响Fig.3 Effect of DPA on the production of inflammatory cytokines

2.4 DPA 对炎症因子mRNA 表达的影响

不同处理对炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10）mRNA 表达量的影响如图4所示。促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 表达量在LPS组中均最高，EPA、DPA 和DHA 处理后，促炎因子mRNA 表达量均有所下降，其中DPA 处理对IL-1β 的基因表达量的抑制作用最强，显著强于EPA和DHA。对于抗炎因子IL-10，其基因的表达量在LPS 组中最低，在DPA 组中最高，其次是DHA 和EPA。

图4 DPA 对炎症因子mRNA 表达量的影响Fig.4 Effect of DPA on mRNA expression of inflammatory cytokines

2.5 DPA 对NF-κB 代谢通路的影响

核转录因子NF-κB（Nuclear transcription factor-κB，NF-κB） 是一类关键性的转录因子，通常以二聚体（p50 和p65）非活性形式存在于几乎所有类型细胞的胞质中，具有十分重要的功能。它与免疫细胞的活化、T 淋巴细胞和B 淋巴细胞的发育、应激反应、细胞凋亡等多种细胞活动有关，正常情况下，NF-κB 与其遏制蛋白IκB 在胞浆中以无活性的三聚体形式存在，炎症发生时，NF-κB发生磷酸化激活，使其从细胞质转位于细胞核，与NF-κB 反应性基因的κB 位点结合激活细胞中的促炎基因，引发炎症级联反应[14-17]。因此，检测p50和p65 的磷酸化水平可以反映细胞中NF-κB 代谢通路的活化水平，从而反映炎症反应水平。DPA对NF-κB 代谢通路中p50 和p65 的磷酸化水平的影响如图5所示。LPS 组中p50 的磷酸化水平最高，p-p50/p50 的值高达0.67，显著高于其它组；EPA、DPA 和DHA 干预可以显著抑制p50 的磷酸化，其中DPA 对p50 磷酸化的抑制作用最明显（p-p50/p50 的值为0.12），DHA 次之（p-p50/p50的值为0.24），EPA 最弱（p-p50/p50 的值为0.37）。p65 的检测结果和p50 具有一致性。

图5 DPA 对p50（a）和p65（b）磷酸化的影响Fig.5 Effect of DPA on the phosphorylation of p50（a） and p65（b）

3 讨论

本文以LPS 诱导的RAW264.7 细胞为炎症的体外模型，采用DPA 对其进行干预，并以炎症介质（NO 和PGE2）和炎症因子（TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-10）的分泌量为指标，评价了DPA 的体外抗炎活性，然后从NF-κB 代谢通路中关键蛋白的磷酸化角度探索了DPA 抗炎的作用机制，为DPA 功能的开发及后续研究提供了参考。

在炎症反应过程中，LPS 作为一种内毒素会导致促炎介质NO 和PGE2 的过量分泌，其中NO是由iNOS 作为限速酶参与合成的，而PGE2 则是由COX-2 作为限速酶参与合成的。NO 是炎症反应中的重要炎症介质，无论急性炎症反应或慢性炎症反应过程都会伴随NO 的过量分泌[18]，因此NO 和iNOS 常用来评价炎症反应的发生程度。PGE2 是类花生酸中的重要一员，是花生四烯酸（AA）经COX-2 合成的[19]，对炎症具有一定促进作用。因此，PGE2 和COX-2 产量可以反映炎症反应的强度。在本文中，通过LPS 诱导的RAW264.7 细胞作为炎症的体外模型，并以NO、PGE2、iNOS 和COX-2 为指标评价了DPA 的体外抗炎效果，并与EPA 和DHA 进行比较，结果表明，DPA 和DHA均具有明显的抗炎效果，这种效果强于EPA。

除了NO、PGE2 这些炎症介质外，促炎因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）和抗炎因子（IL-10）之间的平衡在炎症反应中也发挥了很重要的作用。TNF-α 是炎症因子网络中的关键因子，可以诱导IL-1β 和IL-6 的产生，增强巨噬细胞的敏感性。此外，TNF-α 是一种内生性的致热源，可以导致发热，刺激内皮细胞分泌一系列的炎症因子，这些物质反过来又会诱导TNF-α 的产生。IL-1 是最早发现的白介素，几乎所有的体细胞都可以合成该因子，而巨噬细胞是它的主要合成场所。IL-1 有ILα 和IL-β 两种，其中IL-1β 最为常见，对中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞有趋化作用，大量的IL-1β 进入循环系统引起发热。此外，IL-1β 还可以刺激免疫细胞释放炎症介质，激活转录因子，调控与炎症相关代谢通路。因此，IL-1β 是体内诱导作用最强的炎症介质之一，是调控局部和全身炎症中关键的炎性细胞因子。IL-6 是一类分子质量在21～28 ku 之间的糖蛋白，IL-6 在炎症反应中的作用机制复杂，它既可以触发促炎的级联反应，同时又参与抗炎反应，然而多数研究认为过量的IL-6会起到促炎作用。IL-10 是由巨噬细胞、B 细胞等多种细胞产生的一种具有多种功效的抗炎因子，它的抗炎作用是通过抑制NF-κB 信号通路的活化，降低促炎因子TNF-α、IL-1β 等的释放而发挥作用的。此外，IL-10 在临床上经常作为判断病毒性流感、肾小球疾病、慢性肾衰竭尿毒症及HIV发生程度的指标。正常情况下，机体中的促炎和抗炎因子处在一种动态平衡的状态，当受到外界有害因素诱导时，促炎因子的合成量会大幅增加，抗炎因子的合成会相应减少，这样就导致机体炎症的发生，严重时会诱发相关病变[20]。本研究通过分析样品中炎症因子分泌量及相应mRNA 表达量的差别，评价了DPA 的抗炎效果，并与EPA 和DHA 进行比较，发现DPA 可以有效降低促炎因子mRNA 的表达及合成，增加抗炎因子mRNA 的表达及合成，此外，DPA 在抑制IL-1β 和促进IL-10方面独具特效。

为进一步解释DPA 抗炎的分子机制，以与炎症密切相关的NF-κB 信号通路为切入点，研究了DPA 等n-3PUFA 对该信号通路中关键蛋白p50和p65 磷酸化的影响。结果表明，DPA 可以通过抑制NF-κB 信号通路上的IκB 降解，进而抑制p50/p65 入核与炎症基因作用位点的结合发挥抗炎功效，并且这种抑制效果要显著强于EPA。然而，n-3PUFA 抗炎的分子作用机制十分复杂，涉及到多种机制的共同作用。新的研究表明，DPA 等n-3PUFA 在代谢过程中可以产生消散素、保护素等特殊的消退介质（Specialized pro-resolution mediators，SPMs），这些介质可以通过抑制NF-κB 信号通路的活化，调节巨噬细胞活性，增加对炎症因子的吞噬作用而发挥强的抗炎功效[21-22]。Arita 等[23]采用EPA 来源的消退素RvE1 对大鼠结肠炎进行干预，结果表明RvE1 可以显著提高大鼠的存活率，维持大鼠体重，改善组织病理评分，降低白细胞浸润，下调促炎因子，如TNF-α、IL-12 以及NOS 基因的表达。Janakiram 等[24]的研究表明这些特殊的消退介质可以显著缓解皮肤炎症、腹膜炎和树突细胞转移等症状，在结肠炎方面，甚至可以缓解结肠炎向癌症的转变。此外，不同的n-3PUFA 产生SPMs 途径不同，产物也不尽相同，有研究表明这些消退介质所发挥的抗炎功效甚至比它们的前体还要强[25]。因此，EPA、DPA 和DHA 在抗炎功效方面的差异也很有可能与它们代谢所产生的SPMs不同有关。

4 结论

本文以LPS 诱导的RAW264.7 为炎症的体外模型，研究了DPA 的体外抗炎特性，并与EPA 和DHA 进行比较。结果表明，DPA 可以通过调节炎症因子（TNF-α，IL-1β，IL-6 和IL-10）和炎症介质（NO 和PGE2）的分泌发挥抗炎作用，并且，DPA 在抑制促炎物质IL-1β 和PGE2 以及促进抗炎物质IL-10 的分泌方面独具特效。Western-blot的结果表明，DPA 可以有效抑制NF-κB 信号通路中p50 和p65 的活化，这可能是其发挥抗炎效果的分子作用机制。