花榈木种子际促生真菌对其幼苗生理生化及生长指标的影响*

王婷婷，韦小丽，孔德明，龙莉

(1.贵州大学 林学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省林业学校，贵州 修文 550201；3.毕节市林业局，贵州 毕节 551700)

“种子际”是一个短暂、迅速变化及微生物动态的土壤带，是距离种子1～10 mm受种子萌发影响的土壤[1]。种子渗出物影响着微生物的群落，而微生物也对植物有促进或抑制生长的作用[2]。尽管它对植物的未来发展有很大的影响，但前人对种子际的研究仍然很少。Liu等[3]研究玉米(Zeamays)种子萌发过程中种子际微生物多样性和种群演替动态，并且从中鉴定出一些优势常见菌PGPR；Harman等[4]用从种子际中分离出的球壳菌(Daldiniaconcentrica)和子囊孢子处理种子减少了腐菌引起的种子腐烂。Parke等[5]利用种子际微生物进行生物防治。Mahaffee[6]研究表明细菌在棉花(Gossypiumspp.)种子上的根部定殖潜力有可能促进植物生长的潜力。种子际土壤微生物是了解植物有益微生物与其他微生物群落竞争必要的第一步，种子际微生物的研究成果颇多[4-6]，但是对花榈木(OrmosiahenryiPrain)种子际的研究未见报道。

花榈木属蝶形花科(Papilionaceae)红豆属(Ormosia)，国家二级保护植物，为优良的用材树种[7]。前人对花榈木种子多样性及萌发特性[8-9]、根瘤菌多样性[10]、播种育苗[11]、繁殖生态学特征[12]进行了研究，对种子际真菌的研究未有报道。因此本研究用项目前期已分离得到的6种种子际真菌对花榈木进行接种试验，探索种子际真菌对花榈木幼苗生长及生理的影响，筛选对花榈木苗木有促生效应的微生物，通过有益微生物调控提高花榈木的苗木质量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及其来源

6个菌种来源于贵州省晴隆、三穗、关岭花榈木种子际，已分离纯化鉴定且具有促生功能的真菌，分别为SS-1-6(青霉属Penicilliumsp.)的一种、SS-2-3(拟康宁木霉Trichodermakoningiopsis))、SS-1-3(茎霉属的一种)、QL-3-5(产黑色素短梗霉Aureobasidiummelanogenum)、GL-4-1(菌核青霉Penicilliumsclerotiorum)、GL-3-1(被孢霉属的一种)。

1.1.2 培养基质

培育基质是按一定比例混合的改良基质,由泥炭、蛭石、珍珠岩、木屑按5︰2︰1︰1混合而成，基质置于灭菌锅中灭菌2 h取出冷却备用。

典型断面在管片收敛整治期间，管片水平位移时程曲线见图2，水平位移分布曲线见图3。注浆结束时各断面的水平位移统计见表1。由图2～3和表1分析得到水平位移的动态变化规律主要有：①各个断面的水平位移变化特征均不同，当隧道收敛整治注浆靠近监测断面时，水平位移有明显的突变增加，当注浆位置稍远离监测断面时，水平位移的突变增加减弱；②注浆结束时，最大水平位移主要发生在第352环(即注浆区间中部位置)；③注浆区间中部水平位移由逐渐增大，逐步演变为中间正向水平位移逐渐减小，两侧负向水平位置逐渐增大。

1.1.3 无菌芽苗

接种的幼苗来源于培育的无菌芽苗。花榈木种子用0.5%的福尔马林浸泡30 min后用75%医用酒精消毒15 min，取出用无菌水冲洗；将培育芽苗的基质、松针置于灭菌锅中灭菌2 h后取出冷却备用；用75%的医用酒精擦洗育苗箱(托盘+育苗箱+盖)，将种子播种于灭菌基质中，浇无菌水，最后在表面覆盖3 cm厚的松针，将育苗箱置于25 ℃培养箱中培养25 d以上，待芽苗长出备用。

1.2.5 数据计算及统计分析

培养6种真菌的PDA固体培养基，分别使用10 mm的打孔器在培养基上打菌饼，将5个菌饼放入装有PDB液体培养基(450 mL)的500 mL三角锥形瓶中，每种真菌装3个锥形瓶。用封口膜封好后放入摇床中震荡培养7 d，菌液备用[13]。

1.2 研究方法

2019年6月将灭菌好的无菌基质装入13 cm×9 cm的花盆中，无菌芽苗移栽至盆中，每盆1株，浇无菌水，每个菌种接种30株芽苗。待芽苗生长到15 d，表现稳定后浇菌液，不同菌液按照1×108个/mL的孢子量进行接种，各种菌液取50 mL；1个月浇1次，连续浇3次，以不浇菌液作为对照(CK)。于2019年10月(培养4个月)测定幼苗的生长指标和生理生化指标。

1.2.1 试验设计

1.7 枢纽基因验证 使用测试集GSE73731数据对各枢纽基因进行线性回归分析验证其表达量与肾透明细胞癌进展关系。另外绘制各备选枢纽基因ROC曲线并计算AUC，当AUC>0.7时，该枢纽基因被认为对于区分低级别(grade Ⅰ、Ⅱ)及高级别(grade Ⅲ、Ⅳ)肾透明细胞癌有较高的灵敏度及特异度。进一步利用GEPIA 数据库[12](http://GEPIA.cancer-pku.cn/)对枢纽基因与肾透明细胞癌病理分期及预后相关性进行验证。

1.2.2 侵染定殖观察

每个处理取3株标准株幼苗，将根系剪下清洗后，用FAA固定液浸泡24 h；取出剪成约1 cm长的根段，经过解离—透明—酸化—染色—脱色过程，具体方法参考盛萍萍等[14]和杨亚萍等[15]的方法，最后制片压片放于荧光万能显微镜(型号：DM 3000)下观察拍照。

不同真菌处理的根系总长度、表面积、体积、根尖数均呈显著差异(P<0.05)(表2)。

待生长4个月后，使用钢卷尺、游标卡尺测定每个处理幼苗的苗高(cm)、地径(mm)，并记录叶片数。按苗高、地径平均值±5%的要求在每个处理取5株标准株，整株从容器中取出后冲洗掉基质，用吸水纸擦干水分，将其根、茎、叶剪下测定鲜重(g)，将幼苗根系洗净放入根系扫描仪中扫描测定根系长度(cm)、表面积(cm2)、体积(cm3)、平均直径(mm)、根尖数，最后放入烘箱在80 ℃下烘干至恒重分别称其干重(g)。

颅内肿瘤合并糖尿病患者相较于单纯颅内肿瘤患者病情较重，且围手术期患者血糖控制水平对手术结果产生一定影响。手术对患者而言是一种应激性刺激源，胰岛素拮抗激素分泌量增加易导致患者出现急性并发症。此外高血糖状态下持续性的无氧代谢会导致细胞内酸中毒与乳酸积聚，从而引发一系列的生理反应，如诱导颅内压上升，对术后恢复效果造成影响[6]。因此加强围手术期血糖控制护理十分必要。

1.2.4 生理生化指标的测定

光合特性指标测定：2019年10月选择典型晴天，采用LI-6400便携式光合仪测定7个处理下花榈木幼苗的光合参数，每个处理选取3株标准株进行测定，测定指标包括净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)，每株重复测定3片叶子。

那么利用这个运算符号π(x,y)作为矩阵A和B的求最小值广义交叉乘法的数据层面的运算，而框架层面运算仍然采用普通矩阵乘法的运算法则，可以定义矩阵A和B的剖面求最小值广义交叉乘法如下：

生理生化指标：采用丙酮浸提法测定叶片的叶绿素含量，包括叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素；考马斯亮蓝法测定可溶蛋白、蒽酮比色法测定可溶性总糖和淀粉含量[16]，每个处理重复3次。

不同真菌在幼苗根系的侵染定殖情况如图1显示，回接真菌的幼苗根系均有明显的菌丝定殖在根系表面，对照CK无菌丝定殖在根表面，说明花榈木种子际微生物能成功定殖在幼苗根系上，并同花榈木幼苗根系共生。

1.1.4 菌液的制备

聚焦精准识别。严格对照国家2016年脱贫攻坚工作考核提出的整改要求，认真落实国家建档立卡数据核准、补录、动态调整工作部署，在全省范围开展精准识别“回头看”，不设指标、不设限制，确保不落一户、应进尽进。截至2017年底，全省贫困人口减至87.54万人，贫困发生率降至2.37%。

采用SPASS 18.0软件进行试验数据的方差分析、主成分分析及综合评价，并用Excel辅助绘制图表。

2 结果与分析

2.1 菌种的侵染定殖情况

工程地质勘察通常按照工程设计阶段逐步进行。不同类型的项目有不同的划分阶段。对于工程地质条件简单且具有一定工程资料的中小型工程，也可以适当组合勘察阶段。勘测方法与工作量按照工程类别和规模、勘测阶段、场地工程地质与研究现状的复杂性、工程经验、建筑等级及其结构特点、特殊要求来确定设计与施工。

本研究提出一种配电网大面积停电两阶段恢复的最优路径选取方法，考虑了最大恢复负荷量、恢复路径时限及恢复后网架负荷平衡、恢复期间负荷波动情况，能够充分体现现有网架的网络转供能力，并充分发挥配电自动化系统在恢复供电方案的优势，能适应存在三双接线、单环接线以已经有固定FA的配电网，最终形成多目标Pareto最优解集。之后对有多个可行解的再进行综合评价，智能给出最优方案，而且针对不同的季节有多套综合评价策略，使得选出的最优路径更具有可操作性。

图1 不同真菌处理的根部真菌侵染定殖图

2.2 对花榈木幼苗高、径、叶生长的影响

不同真菌处理的花榈木芽苗接菌后的地径差异显著(P<0.05)，苗高差异不显著(P>0.05)(表1)。其中SS-1-6处理的地径最大，SS-2-3处理的地径最低；叶片数一致，均为10片。说明不同真菌处理后，对幼苗的地径影响较大；SS-1-6处理对花榈木的地径有明显促进作用。

表1 不同真菌处理对花榈木幼苗高、径、叶生长的影响

2.3 不同真菌处理对幼苗的根系生长发育的影响

1.2.3 生长指标的测定

表2 不同真菌处理的幼苗根系差异Tab.2 Root differences of seedlings treated with different fungal treatments

由表2可知，根系总长度变幅为68.8～237.85 cm，其中SS-1-3处理的最长，GL-3-1处理的最短，相差3.5倍，SS-1-6处理比CK高1.3倍；表面积变幅为15.83～53.78 cm2，其中SS-1-3处理的最大，GL-3-1处理的最小，相差3.4倍，SS-1-3处理比CK高1.6倍；根体积变幅为0.46～1.63 cm3，其中SS-1-6处理的最大，GL-3-1处理的最小，相差3.5倍，SS-1-6比CK高1.7倍；根平均直径变幅为0.42～0.98 mm，其中GL-1-4处理的最大，GL-3-1处理的最小，相差2.3倍，GL-4-1比CK高1.2倍；根尖数变幅为67～267根，其中SS-2-3处理的最多，GL-3-1处理的最少，相差4倍，SS-2-3处理比CK高1.8倍。总体上看，SS-1-3和SS-1-6处理可促进幼苗根系生长。

2.4 不同真菌处理对幼苗生物量的影响

不同真菌处理的幼苗根、茎、叶干重、总生物量均呈显著差异(P<0.05)，茎干重差异不显著(P>0.05)。表3显示，根干重的变幅为0.157～0.213 g，QL-3-5处理的最高，SS-1-6处理的最低，相差1.4倍，QL-3-5处理比CK高1.2倍。叶干重变幅为0.17～0.219 4 g，QL-3-5处理的最高，GL-3-1处理的最低，相差1.5倍，QL-3-5处理比CK高1.4倍。总生物量变幅0.481～0.63 g，QL-3-5处理的最高，GL-3-1处理的最低，相差1.3倍，QL-3-5处理比CK高1.2倍。

表3 不同真菌处理对幼苗生物量的差异Tab.3 Differences of seedling biomass under different different fungal treatments g

2.5 不同真菌处理对花榈木幼苗光合参数的影响

通过方差分析结果显示(表4、表5)：不同真菌处理幼苗的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b、类胡萝卜素含量和净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)差异不显著(P>0.05)，说明不同真菌处理对幼苗的光合及叶绿素无显著影响。

志愿服务指在不考虑回报的前提下，为改善社会，促进人类进步而自愿付出个人的时间及精力所做出的服务性工作，是衡量城市文明程度的重要标志，也是文明大学生素质的重要体现。大学生志愿服务包括环境保护、应急救助、扶贫开发、大型赛会、社区建设等，在团中央的指引下，越来越多的高校大学生愿意参与到志愿服务当中，志愿服务不仅是促进社会和谐发展的优化主体，也是高校思想政治教育的有效载体，同时为培育志愿精神和服务基层的潜在化意识提供了必要的支撑。基层服务主要是继高校扩招之后，国家和社会需要有更多的高校毕业生扎根基层，为基层大发展贡献青春和力量。

表4 不同真菌处理光合参数差异

表5 不同真菌处理间叶绿素的差异

2.6 不同真菌处理对幼苗生理生化指标的影响

不同真菌处理的幼苗可溶性蛋白、可溶性总糖、淀粉含量均呈显著差异(P<0.05)(表6)。可溶性蛋白的变幅为1.327～3.794 mg/g，SS-1-6处理的最大，SS-1-3处理的最小，相差2.86倍，SS-1-6处理比CK高1.6倍；可溶性总糖变幅为33.369%～43.94%，SS-1-6处理的最大，GL-4-1处理的最小，相差1.32倍，SS-1-6处理比CK高1.1倍；淀粉含量变幅为18.209%～41.572%，SS-1-6处理的最大，GL-3-1处理的最小，相差2.3倍，SS-1-6处理比CK高1.6倍。

第三，“南海核心利益说”与2009年来不断趋紧的南海局势联系紧密。2009年来中国的南海立场不断面临严峻挑战。一方面美国频繁的近海抵近侦察直接造成“无暇号事件”，中美之间关于专属经济区航行自由的权利之争使得中国相关国内法面临挑战；同时还严重威胁九段线的相应权利。大多数西方学者认为，中国九段线的实质就是视南海为中国的内湖，而美国所主张的航行自由根本不认同该观点。

表6 不同真菌处理生理生化的差异

2.7 不同真菌促进生长效果的主成分分析及综合评价

进行主成分分析之前，对不同真菌处理的幼苗的苗高、地径、生物量、总根长、根表面积、根体积、根直径等11个指标进行KMO系数检验，结果显示(表7)：剔除KMO检验系数低于0.7以下的指标，故排除苗高0.555和淀粉0.49。

表7 不同真菌各指标的KMO系数检验

主成分分析结果(表8)显示：选3个成分为主要影响因子。主成分1(PRIN1)、主成分2(PRIN2)、主成分3(PRIN3)的特征根分别为5.614、2.624、1.151，贡献率分别为51.032%、23.858%、10.46%，累计贡献率为85.355%。总根长、根表面积、根体积、根直径、根尖数为主成分1(PRIN1)的因子，第1主成分反映了根系生长状况的变异；地径、可溶性总糖、可溶性蛋白为主成分2(PRIN2)的因子，第2主成分反映了幼苗生长和生理的差异；生物量是主成分3(PRIN3)的因子，所有因子的参数均为正载荷。

表8 不同处理各指标主成分分析的特征根和特征向量

综合评价结果显示(表9),第1主成分排名前三的真菌是SS-1-6、GL-4-1、SS-2-3；第2主成分排名前三的是SS-1-6、GL-3-1、CK；第3主成分排名前三的是QL-3-5、CK、GL-4-1；综合排名根据促生效果优劣排序SS-1-6>GL-4-1>SS-1-3>SS-2-3>CK>QL-3-5>GL-3-1。

表9 不同真菌处理主成分分析及综合评价

3 讨论与结论

目前关于根际微生物[17-19]的研究已经十分广泛，苗期研究是观察植物后期生长是否同苗期生长一致的重要研究阶段[20]。植物生长指标是最为直观和简单的判别方法[21]，结合生理生化的指标测定可充分说明微生物对植物的影响。

对不同真菌处理在花榈木幼苗根系上的侵染定殖情况进行观察，发现种子际真菌已成功定殖在根系上，并和植物共同生长，这与Howie[22]研究结果一致，而在CK处理的根系上无发现菌丝。不同真菌处理的幼苗地径、生物量、根系指标、可溶性总糖、可溶性蛋白、淀粉呈显著差异(P<0.05)；种子际真菌来自三穗的SS-1-6、SS-1-3、SS-2-3处理在根系指标上表现较好，但来自关岭种子际真菌GL-3-1处理的幼苗生长指标比CK处理的还差。可溶性总糖、可溶性蛋白、淀粉指标均是植物物质代谢的重要指标，有3个真菌在可溶性蛋白和可溶性总糖指标比CK处理好，有4个菌种在淀粉含量上比CK处理好，说明具有促生功能的真菌对植物生长的促进作用并不是绝对的，有的促生真菌对植物生长反而有抑制作用。光合生理指标是植物重要的生理参数，但结果表明不同真菌处理的花榈木幼苗光合参数指标差异不显著(P>0.05)，说明本研究中所用的促生真菌对植物光合无促进作用，与林燕青等[23]研究结论不一致，原因可能因为微生物种类及树种不同以及促生功能的强弱不同导致。

通过主成分分析和综合评价初步评价出对花榈木幼苗生长促进效果排名前三的真菌分别是：来自三穗的SS-1-6(青霉属的一种)和SS-1-3(茎霉属的一种)，关岭的GL-4-1(菌核青霉)。但本研究对苗期研究时间较短，幼苗后期生长生理的变化是否同苗期一致还有待研究，且仅针对单一菌株接种，对花榈木幼苗的促生效果并不是十分突出和明显，混合菌种接菌效果以及促进效果更好的微生物研究还有待探索，以期为花榈木高效生产化育苗提供技术上的指导。