白藜芦醇对核桃细菌性黑斑病菌的抑制作用

李峰 陈雯雯 邓江丽 毛清黎 权文利 毛雅慧

（1. 湖北工程学院 特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室/生命科学技术学院，孝感 432000；2. 武汉生物工程学院食品科技学院， 武汉 430415）

植物能产生多种具有抗菌活性的次生代谢产物，植物源杀菌剂正是利用植物体内的这些抗菌活性物质或通过诱导植物产生防卫素，从而起到杀死或有效抑制某些病原微生物生长的作用。由于植物源抑菌剂具有来源广泛，靶标性强，作用广谱，无毒易降解等优点，成为开发新型农药的首选［1］。中药虎杖具有利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰功效，主用于治疗跌打损伤，肺热咳嗽［2-3］，白藜芦醇为其主要活性成分之一。

白藜芦醇化学名称为3，5，4’-三羟基-1，2-二苯乙烯（化学式为C14H12O3），是一种非黄酮类多酚化合物，也是一种“植物抗毒素”［4］。大量动物实验均表明，白藜芦醇有抗氧化［5］、抗炎症、抗癌［6］、抗糖尿病［7］及心血管保护［8-9］等多种药理作用［10］，在临床医学领域收到广泛关注。作为一种“植物抗毒素”，科研工作者也逐渐对其抗菌活性产生了兴趣，吴翠霞等［11］研究表明白藜芦醇及其衍生物对6种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发具有一定抑制作用；李永军等［12］通过体外抗菌实验，证明了白藜芦醇对Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus（MSSA）、Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）和Coagulase Negative Staphylococci（CONS）等葡萄球菌具有较强的抗菌效果；另外，白藜芦醇对绿脓杆菌、福氏痢疾杆菌、肺炎双球菌和雷极普罗维登斯菌等均有良好的抗菌作用［13］。从收集的相关文献看，目前白藜芦醇在农业领域的研究甚少，尽管已证实白藜芦醇能够抑制葡萄上的灰霉菌和根霉菌的生长，从而有利于抑制水果储藏过程中微生物的滋生［14］，但目前暂未明确其对植物病原菌的抑菌谱及相应的抑菌机制，且其能否开发成为新型植物源杀菌剂，仍然需要更多研究佐证。

核桃细菌性黑斑病，是世界性核桃病害，严重影响了核桃的产量和品质［15］。目前，国内外防治核桃细菌性黑斑病主要是使用以波尔多液为主的保护性铜制剂［16］，配合用甲基托布津、代森锰锌、农用链霉素、青霉素钾盐等药剂进行综合防治［17］，化学农药的使用将导致农药残留、食品安全及生态平衡破坏等问题。本文以引起核桃细菌性黑斑病的主要病原物Xanthomonas arboricola pv. juglandis DW3F3（Xaj DW3F3）为供试菌株，测定了白藜芦醇对该细菌的最低抑菌浓度（MIC）以及最低杀菌浓度（MBC），并在亚抑菌浓度下，通过生物化学方法对病原细菌的群体运动性、胞外酶分泌能力、胞外多糖分泌能力及生物被膜形成能力进行了检测，旨在为核桃细菌性黑斑病天然杀菌剂的开发提供理论依据，同时也丰富白藜芦醇的抑菌谱，为其在农林作物病害防治上的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 树生黄单胞核桃致病变种Xanthomonas arboricola pv. juglandis DW3F3（Xaj DW3F3），为从丹江口核桃园内采集的病变核桃果上分离出的病原物，保藏于湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室。

1.1.2 培养基 （1）YPG培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，pH 7.0；（2）YPGA培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，琼脂15.0，pH 7.0；（2）胞外蛋白酶检测培养基：YPGA中含1%（W/V）的脱脂奶粉；（3）胞外淀粉酶检测培养基：YPGA中含0.1%（W/V）的可溶性淀粉；（4）胞外纤维素酶检测培养基：YPGA中含有0.5%（W/V）的羧甲基纤维素（CMC）；（5）运动性检测培养基（swarming平板）：YPG中含0.5%琼脂糖。

1.1.3 主要试剂和仪器 白藜芦醇（虎杖提取物），纯度≥98%，由国家植物功能成分利用工程技术研究中心惠赠；头孢氨苄（Cef），工作浓度为30 μg/mL，购于上海生工生物工程有限公司；刚果红、结晶紫购于上海生工生物公司；其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。主要仪器如下：超净工作台SW-CJ-2G（苏州净化设备有限公司），恒温培养箱（北京中兴伟业仪器有限公司），立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-75KBS（上海申安医疗器械厂），双光束紫外-可见分光光度计UV-6100S（上海美谱达），恒温震荡式摇床ZQTY-50NS （上海知楚）。

1.2 方法

1.2.1 白藜芦醇抑菌活性的初步鉴定 利用K-B滤纸片法检测白藜芦醇对Xaj DW3F3的抑菌效果。将白藜芦醇溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，配制成浓度为30 mg/mL的母液备用。准备好Xaj菌悬液，用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于YPG固体平板上，将已灭菌并干燥好的直径为5 mm圆形滤纸片放置于涂布有菌液的培养基表面，每皿3片，再将配制好的白藜芦醇母液滴加于滤纸片上，同时以溶剂DMSO作阴性对照，将平板晾干后置于28℃培养箱培养2 d，观察结果并记录，实验设置3个重复。

1.2.2 最低抑菌浓度 （MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的确定 接种Xaj于YPG液体培养基中，28℃震荡培养至平台期，再取10 μL菌液接种至新鲜的YPG液体培养基中，并加入不同浓度的白藜芦醇溶液，使其终浓度分别为：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 μg/mL，DMSO作为阴性对照，28℃震荡培养2 d后，分别测定600 nm处吸光值，MIC即为白藜芦醇能够显著抑制Xaj生长的最低浓度值；选择大于MIC浓度的各管菌悬液，分别取20 μL涂布于YPG固体平板上，28℃培养2 d，培养基上无细菌生长的最低浓度为其MBC，每个浓度设置3个重复。

1.2.3 生物膜形成能力检测 用结晶紫染色法检测白藜芦醇对Xaj生物膜形成的影响。接种Xaj于5 mL YPG液体培养基中，28℃震荡培养至对数期，离心收集菌体，用1 mL YPG培养基重悬菌体，接种至装有4 mL YPG培养基的玻璃指形管中，并加入终浓度为15 μg/mL的白藜芦醇，DMSO作为阴性对照，置于28℃培养箱中静置培养5 d后，倒掉培养液，无菌水洗管壁3次，烘干加入6 mL 1%的结晶紫染色30 min。倒掉染色液，用无菌水冲洗管壁，烘干指形管，观察管壁上是否有一圈紫色物质，拍照记录；用1 mL无水乙醇溶解管壁结晶紫，测定630 nm处吸收值并记录，实验设置3个重复。

1.2.4 胞外多糖形成能力检测 利用液体摇瓶发酵法测定Xaj在终浓度为15 μg/mL的白藜芦醇作用下产生EPS的量。接种Xaj于YPG液体培养基中，28℃震荡培养至平台期，再按1%-2%的量转接至50 mL新鲜YPG液体培养基中，并加入终浓度为15 μg/mL的白藜芦醇，DMSO作为阴性对照，28℃震荡培养5 d后，向培养液中注入4倍体积的无水乙醇，边注入边搅拌，然后挑出絮状沉淀物，置于55℃烘箱中烘干，称重，记录，并计算培养物形成EPS的量（g/L），实验设置3个重复。

1.2.5 胞外酶分泌能力的检测 本研究采用平板检测法分别检测了白藜芦醇对Xaj分泌胞外蛋白酶、胞外淀粉酶及胞外纤维素酶能力的影响。

1.2.5.1 胞外蛋白酶 接种Xaj于YPG液体培养基中，28℃震荡培养至平台期，用移液器分别吸取2 μL菌液接种于含1%的脱脂牛奶和终浓度为15 μg/mL的白藜芦醇的YPG平板上，DMSO作为阴性对照，静止10 min。28℃培养2 d，通过比较菌落周围水解透明圈的有无或大小判断菌株产胞外蛋白酶的活性。

1.2.5.2 胞外淀粉酶 接种Xaj于YPG液体培养基中，28℃震荡培养至平台期，用移液器吸取2 μL菌液接种于含0.1%可溶性淀粉和终浓度为15 μg/mL的白藜芦醇的YPG平板上，DMSO作为阴性对照，静止10 min。28℃培养2 d后，用1∶100的I∶KI（0.08 mol/L I2，3.2 mol/L KI）溶液染色10 min，然后用70%的酒精洗平板，能产生胞外淀粉酶的菌株，其菌落生长处及周围可形成无色透明圈，观察并测量透明圈的大小。

1.2.5.3 胞外纤维素酶 接种Xaj于YPG液体培养基中，28℃震荡培养至平台期，用移液器吸取2 μL菌液接种于含有0.5%（W/V）的羧甲基纤维素（CMC）和终浓度为15 μg/mL的白藜芦醇的YPG平板上，DMSO作为阴性对照，静置10 min。28℃培养2 d后，在平板上加入约20 mL 0.1%的刚果红（Congo Red）染色30 min，水洗两次，再用20 mL 1 mol/L的NaCl脱色两次，每次约20 min，能产生纤维素酶的菌株，其菌落生长处及周围形成一透明圈，观察并测量透明圈的大小。

实验分别设置3个重复，计算透明圈直径的平均值。测得的透明圈的直径大小代表不同胞外酶活性或产量的高低，由此来比较菌株在不同环境下所产胞外酶的差异。

1.2.6 运动性检测 接种Xaj于YPG液体培养基中，28℃震荡培养至平台期，用移液器吸取2 μL菌液点接于含有0.5%琼脂糖和和终浓度为15 μg/mL的白藜芦醇的半固体培养基平板上（平板使用前在超净台晾5-10 min），DMSO作为阴性对照，正置于超净台中待晾干，再置于28℃正置培养2 d，观察菌苔的扩散情况并测量菌苔直径，进行统计分析，实验设置3个重复。

1.2.7 数据处理方法 采用Excel 2010进行数据处理，并采用t检验进行显著性分析。P < 0.05，有统计学差异（*）；P < 0.01，差异显著（**）；P < 0.001，差异极显著（***）；P ＞ 0.05差异不显著（NS）。

2 结果

2.1 白藜芦醇对Xaj抑菌活性分析

采用K-B滤纸片扩散法测定白藜芦醇对Xaj的抑菌活性，结果如图1-A所示，在滴加有白藜芦醇的滤纸片周围形成了明显透明圈，而滴加有DMSO的对照组滤纸片周围无透明圈，说明白藜芦醇能有效抑制Xaj的生长。随后采用浓度梯度稀释法测定白藜芦醇对Xaj的最低抑菌浓度（MIC）及最低杀菌浓度（MBC），由图1-B可见，白藜芦醇的浓度在20 μg/mL时能够显著抑制Xaj的生长（P < 0.01），因此，白藜芦醇对Xaj的最低抑菌浓度（MIC）为20 μg/mL；随着白藜芦醇浓度的升高，抑制活性越强，当白藜芦醇浓度达到45 μg/mL时，基本能够完全抑制Xaj的生长，即最低杀菌浓度（MBC）为45 μg/mL；在亚抑菌浓度（5 μg/mL、10 μg/mL和15 μg/mL）下，白藜芦醇均不能显著抑制Xaj的生长（P ＞ 0.05）。

图1 白藜芦醇对Xaj的抑菌活性检测Fig. 1 Detection of the antibacterial activity of resveratrol against Xaj

2.2 白藜芦醇对Xaj生物被膜形成的影响

本研究采用结晶紫法分析白藜芦醇在亚抑菌浓度下对Xaj生物被膜（bacterial Biofilm，BF）形成能力的影响。结果发现，在添加15 μg/mL白藜芦醇的情况下，Xaj在指形管壁上形成的紫色圈明显少于阴性对照组（图2-A）；再用无水乙醇溶解管壁结晶紫，比较实验组与对照组生物被膜的形成量，发现添加15 μg/mL白藜芦醇情况下形成生物被膜量仅为对照组的40%左右（图2-B），表明在15 μg/mL的亚抑菌浓度下，白藜芦醇能够显著抑制Xaj生物被膜的形成。

图2 白藜芦醇对Xaj生物被膜形成的影响Fig. 2 Effect of resveratrol on Xaj biofilm formation

2.3 白藜芦醇对Xaj产胞外多糖的影响

本研究通过液体摇瓶发酵法测定白藜芦醇对Xaj胞外多糖（EPS）产生的影响，发酵5 d后进行观察。在未添加白藜芦醇时，Xaj的EPS产量为7.47 mg/mL；而添加15 μg/mL白藜芦醇进行培养时，发酵液中基本无絮状沉淀物产生，EPS产量基本为0 mg/mL（图3），表明在15 μg/mL的亚抑菌浓度下，白藜芦醇对Xaj的EPS产生有明显抑制作用。

图3 白藜芦醇对Xaj产胞外多糖的影响Fig. 3 Effect of resveratrol on extracellular polysaccharide production by Xaj

2.4 白藜芦醇对Xaj分泌胞外酶的影响

利用添加相应物质的固体平板，分别在亚抑菌浓度下检测了白藜芦醇对Xaj分泌胞外酶（蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶）的影响。研究结果显示，添加15 μg/mL白藜芦醇能够显著抑制Xaj的蛋白酶的分泌（图4），对淀粉酶的分泌有促进作用（图5），而对纤维素酶的分泌没有影响（图6）。

图4 白藜芦醇对Xaj分泌胞外蛋白酶的影响Fig. 4 Effect of resveratrol on extracellular protease secreted by Xaj

图5 白藜芦醇对Xaj分泌胞外淀粉酶的影响Fig. 5 Effect of resveratrol on extracellular amylase secreted by Xaj

图6 白藜芦醇对Xaj分泌胞外纤维素酶的影响Fig. 6 Effect of resveratrol on extracellular cellulase secreted by Xaj

2.5 白藜芦醇对Xaj运动性的影响

通过运动性半固体平板进行运动性实验。结果表明在浓度为15 μg/mL时，白藜芦醇对Xaj运动性没有影响（图7）。

图7 白藜芦醇对Xaj运动性的影响Fig.7 Effect of resveratrol on Xaj motility

3 讨论

胞外多糖是生物膜的主要组成成分，它在抑制植物防卫反应，及菌体生物膜的形成中扮演着重要角色［18］。本研究表明一定量的白藜芦醇能明显抑制核桃细菌性黑斑病菌胞外多糖的产生，对生物膜的形成也有抑制作用，测定的胞外多糖合成量与生物膜的形成情况成正相关，与理论相符。植物细胞壁是病原菌入侵的主要屏障之一，而植物病原细菌可通过II型分泌系统（T2S）分泌降解植物细胞壁的酶（主要有纤维素酶、淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等）及多种毒性因子，破坏寄主细胞，从而达到进入寄主体内并获得生长繁殖所需的营养的目的［19］。在检测白藜芦醇影响胞外酶分泌的研究中，白藜芦醇既有促进效果，又有抑制作用，说明细菌分泌的3种胞外酶的活性不同，对白藜芦醇具有不同的敏感性。研究可见纤维素酶的水解透明圈非常明显，较另外两种酶的圈直径都大，表明该病原菌具有较强的纤维素酶分泌能力（与之前已发表的数据一致［20］），因此，浓度为15 μg/mL的白藜芦醇不足以抑制其纤维素酶的分泌，后续研究中将选用更高的亚抑菌浓度进行相关实验。

近几年，我国局部核桃生产地区的细菌性黑斑病的发生随着种植面积不断扩大而愈发严重。目前，我国对于核桃黑斑病的研究还处于初步阶段，缺乏系统和深入的研究，且采取的防治方法都存在一定的局限性，如选育抗病品种过程繁琐而且周期过长，抗性品种的选育与推广速度远远低于病原菌变异的速度；外源喷洒含铜化学农药（或铜锌制剂与抗生素类农药交替使用）的化学防治方法虽然是目前较为有效的黑斑病防治手段，但长期使用将导致农药残留，造成抗铜细菌的滋生，引起食品安全及生态平衡破坏等弊端。因此，开发科技含量的防病技术与绿色环保药物，进行综合性科学防治，以高效控制核桃细菌性黑斑病的发生是当下一项重要任务。

由于植物中白藜芦醇的含量很低，加之提取与制备工艺复杂，且需要获得较高纯度才能达到一定抑菌效果，因此将其作为天然杀菌剂进行应用的成本颇高，可考虑用化学方法人工合成白藜芦醇衍生物，并对其抑菌效果及杀菌谱进行研究验证，为开发合适的新型抑菌剂提供理论依据。在利用其抗菌活性的同时，其与已知抗菌药物潜在的协同作用也是一个不容忽视的重要方面，与其他抗菌剂的配合使用是否可增加药效，也是值得考虑的问题。目前，关于白藜芦醇抑菌的研究，主要集中在人体致病菌，少见对植物致病菌抑制效果的报道，因此在农业方面的应用稍有欠缺，应更多地关注其对于农林作物病害的防治。在未来，需要更多的研究来阐明白藜芦醇被开发成生物制药产品和新型植物源农药的潜力。

本研究发现白藜芦醇对核桃细菌性黑斑病菌的毒力因子产生的表型均有一定影响，但关于白藜芦醇抑制核桃细菌性黑斑病病原菌的机制目前尚不清楚，有待深入研究。研究表明脂肪酸合成代谢与病原菌致病性具有相关性［21］，因此可联系该细菌脂肪酸合成代谢途径中关键基因的功能，进一步确定白藜芦醇的作用靶点，探讨其作用机制。有研究报道白藜芦醇能抑制奇异变形杆菌的迁徒生长，推测原因是白藜芦醇作用于一种含组氨酸的磷酸根离子的细菌双组分信号系统［22］。双组分信号转导系统（twocomponent signal transductionsystem，TCSTS）是原核细胞中一种非常重要的信号传递机制，也是细菌最主要的感应-响应调节机制［23］。而DSF依赖的群体感应系统是调控病原微生物致病性和环境适应性的重要方式，也是防治植物细菌性病害的重要切入点。鉴于此，课题组拟开展“白藜芦醇与环二鸟苷酸代谢相关酶（一种TCSTS受体/感应蛋白）的相互作用”的研究，建立白藜芦醇与细菌DSF群体感应之间的关联。另外也可通过扫描电镜和透射电镜动态地观察在白藜芦醇作用后，细菌细胞微观结构的变化，或利用电导率仪测定细胞膜的通透性，从而揭示其作用机制。

4 结论

本研究通过K-B滤纸片法初步确定白藜芦醇对核桃细菌性黑斑病菌XajDW3F3具有抑制作用。在此基础上，进一步通过液体培养法，测定了白藜芦醇对Xaj的最低抑菌浓度（MIC）为20 μg/mL，以及最低杀菌浓度（MBC）为45 μg/mL。并选择在亚抑菌浓度为15 μg/mL的条件下检测白藜芦醇对Xaj毒力因子的影响。研究结果表明在此浓度下白藜芦醇能够显著抑制Xaj生物被膜的形成；对该菌对胞外多糖（EPS）的产生也有明显抑制作用；而在检测对胞外酶分泌的影响时发现白藜芦醇能够显著抑制Xaj的蛋白酶的分泌，对淀粉酶的分泌却有促进作用，而对纤维素酶的分泌没有影响。另外运动性实验结果显示白藜芦醇对Xaj运动性没有影响。