人参杞黄颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定

李素凯，刘露，刘梦燕，李萍，陈笑宇，李冬冬，杨锦竹※，王伟

（1.吉林大学，吉林 长春 130012;2.吉林省食品检验所，吉林 长春 130012）

人参杞黄颗粒是以黄芪、人参和枸杞经提取、浓缩、干燥得到的干膏粉碎后与糊精、甜蜜素和糖精钠等辅料混合、以88%的乙醇制粒而得到的中药制剂。黄芪为豆科植物膜荚黄芪[Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.]或蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus（Fisch）Bge.Var.mongholicus（BgRe.）Hsio]的干燥根[1]。黄芪气微，味微甜，性微温，具有提高免疫、益气保肝、托疮利尿、减缓衰老、抗应激及抗菌等广泛作用。可食用可药用，用于临床和保健食品的研制。黄芪含有皂甙类、多糖类和黄酮类等多种化学成分[2]，研究表明，黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪的活性指标成分，有相关研究也报道了毛蕊异黄酮苷的含量测定方法[3-8]，将毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为指标去评价黄芪的文献近400篇，通过阅读就会发现药典中黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法对黄芪药材的含量测定效果较好，但是涉及到成分复杂的中药制剂往往就不能够达到想要的效果，而且目前约15%临床使用的方剂中均含有黄芪，且多作为君药使用[9]。如果使用药典中的测定方法，由于毛蕊异黄酮葡萄糖苷出峰时间太早（约11 min），分离效果差，那么大多数复方中黄芪的质量标准是没办法制定的，所以在此情况下会通过改变色谱条件以控制质量标准，目前我们常见的中药制剂均采用企业自拟标准，而且至今也尚未形成国家统一的质量标准[10,11]。为了有效控制和评价人参杞黄颗粒的质量，我们通过改善药典中黄芪的供试品处理方法和加大甲酸比例、加长流动相大极性段洗脱时间等方法到达分离目的，从而建立人参杞黄颗粒中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量测定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器设备

Acchrom S3000型高效液相色谱仪（华谱科技有限公司）；Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m）色谱柱（苏州赛分科技有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限责任公司）；Sartorius BT 25s电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试剂与材料

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号111920-201606，中国食品药品检定研究院）；人参杞黄颗粒为实验室自制（人参、黄芪、枸杞子按1:1.72:1.84比例配比，辅料为糊精、甜蜜素、糖精钠。颗粒剂规格为8 g/袋，食用方法为每日1次，1袋/次）；乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；甲酸（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）；水为试验室双蒸水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱填充柱：Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m），流动相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A）；检测波长：260 nm；流速：1 mL/min；柱温：25℃；进样量：20L。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品1 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液。

2.3.1 药典色谱条件 参考药典“黄芪”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的色谱条件[12]。以Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m）为色谱柱，乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0~20 min，20%→40%A；20~30 min，40%A）；流速为1 mL/min；柱温为25℃；进样量为20L，进行测定，得到结果见图1。

2.2.3 黄芪阴性对照溶液的制备 取除黄芪以外的两种药材进行提取干燥与辅料进行制粒，将所得产品按“2.2.2”中方法进行处理，得到阴性对照溶液。

2.3 优化毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定色谱条件

2.2.2 供试品溶液的制备 取人参杞黄颗粒，磨成粉，过四号筛，精密称定7 g，加入到圆底烧瓶中，量取甲醇50 mL加入并进行称定，放置于水浴锅中加热回流4 h，放冷，再进行称定，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，回收溶剂至干，得供试品残渣，备用；将少量脱脂棉放在内径为15 mm层析柱的出口处，加入乙醇处理好的D101大孔树脂适量，高度约为20 cm，用蒸馏水冲洗大孔树脂，直至流出的液体不呈白色浑浊且无味为止，将上述供试品残渣溶于10 mL蒸馏水中，完全转移至层析柱上，用200 mL蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，再用20%乙醇200 mL进行洗脱，弃去洗脱液，最后用70%乙醇200 mL进行洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，用甲醇定容到10 mL量瓶中即得。

图1 药典色谱条件下两种样品的HPLC图Fig.1 The HPLC chromatograms of 2 kinds of samples under the pharmacopoeia chromatogram condition

2.4.5 重现性试验 按照“2.2.2”项下供试品溶液制备的方法对6份同一批次人参杞黄颗粒的样品进行处理，取各溶液20L，注入HPLC仪器中进行测定，记录峰面积。结果表明，6份人参杞黄颗粒的平行样中所含的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量平均值为2.562 mg/g，RSD为0.757 6%（n=6），说明该方法的重现性良好。

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图2 色谱条件优化后和大孔树脂洗脱后的供试品HPLC图Fig.2 HPLC diagrams of test products after optimized chromatographic conditions and elution of macroporous resin

2.4 方法学考察

2.4.4 稳定性试验 将同一份供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件在0、2、4、8、12、24 h时进样，测定峰面积，得到RSD为1.340 9%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

图3 人参杞黄颗粒中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷的HPLC图Fig.3 HPLC diagrams of Calycosin Glycoside in Renshen Qihuang Granules

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2.4.6 加样回收试验 精密称取6份人参杞黄颗粒粉末，计算颗粒粉末中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，再将等量毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品加入到6份粉末中，按照“2.2.2”项下供试品溶液处理方法进行制备，计算各样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷实测值，计算平均回收率为99.26%，RSD为0.81%（n=6）（表1），表明该测定方法回收率良好。

2.4.2 线性关系考察 将“2.2.1”项下的对照品溶液用甲醇逐步稀释，得到浓度分别为0.004mg/mL、0.008mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.020 mg/mL及0.024 mg/mL的一系列毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，依次进样，记录得到的峰面积并绘制标准曲线，毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程为y=55201x-6.0087（r=0.9996），线性范围为0.004~0.024 mg/mL，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在此浓度范围内呈较好的线性关系。

2.4.1 专属性考察 将“2.2”项下各个溶液通过微孔滤膜过滤后注入自动液相仪器中进行测定，得到色谱图见图3：

2.3.2 药典色谱条件优化 经过查阅资料并进行多次试验发现，当以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A），检测波长为260nm，柱温为25℃，流速为1.0mL/min的色谱条件时峰位置的前后色谱峰对其干扰小，但是其分离度未能达到要求。所以将供试品过大孔树酯进行洗脱，除杂，使其分离度达到要求。两种情况色谱图见图2。因此，确定该条件为毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的优选色谱条件。

2.4.3 精密度试验 将“2.2.2”项下的供试品溶液，按照时间顺序连续进6次，每次进样20L，记录峰面积，求得峰面积的RSD值为0.7449%（n=6），表明仪器精密度良好。

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表1 加样回收率试验结果Table 1 The results of recovery tests

2.4.7 样品含量测定 从3批人参杞黄颗粒中各取3个平行样，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备的方法进行处理，分别吸取20L，注入HPLC仪器中进行测定，3个批次平行样平均值分别为2.688 mg/100g、2.668 mg/100g、2.630 mg/100g。3批含量RSD值为1.494 7%。表明该品毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量稳定，均一性良好。

[36]Royal Government of Cambodia,“Political Platform of Royal Government of Cambodia of the Fifth Legislature of National Assembly”, https://www.cambodianembassy.org.uk/f_home/PDF/Political_Platform_Royal_Government_Cambodia_5th.pdf, 2013年9月。

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3 讨论

在研究中，采用药典方法得到的毛蕊异黄酮葡萄糖苷色谱峰基线不能分离，可能是由于中药制剂的成分复杂，杂质干扰作用大[13]。通过多次实验摸索，梯度洗脱为（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A），流速为1.0 mL/min时，能够使出峰位置受到的干扰最小，但是由于前面的杂质太多使得毛蕊异黄酮葡萄糖苷的分离效果达不到预期，我们又进一步将供试品溶液通过大孔树酯进行洗脱，处理得到新的供试品溶液，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷与杂质峰能够有效分离，分离度＞1.5，因此，确定该条件为毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的优选色谱条件。后对其进行方法学验证，发现该毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定方法专属性较好，阴性无干扰，分离度能达到要求，重复性、精密度、稳定性和回收率等均符合要求，可用于人参杞黄颗粒的质量标准控制。

之后实验遇到杂质成分过多的情况，可优先考虑改善前处理方法，再进行色谱条件优化，以减少摸索时间。此方法条件下毛蕊异黄酮葡萄糖苷出峰位置前后有一段范围的无干扰区域，所以其他黄芪的中药制剂可根据此方法通过增大和减小流速来使出峰位置合适，希望能对以后的实验研究有所帮助。