丹参多糖对氟苯尼考导致的肉鸡生长抑制和肝功能损伤的缓解作用

韩 超，李淑颖，耿玉萌，史万玉，包永占

(河北农业大学 中兽医学院，河北 保定 071001)

药物性肝损伤(drug induced liver injury，DILI)是指人体暴露于常规剂量或高剂量药物后，因药物本身或其代谢产物对肝脏的直接毒性，或人体对药物或其代谢产物产生过敏或代谢特异质反应而导致的肝脏损伤，是肝生化异常与急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)的常见原因之一[1-3]。在所有引起药物性肝损伤的因素中，抗生素被报道的最多，研究发现青霉素类、氯霉素类和大环内酯类等都是极易引起药物性肝损伤的抗生素种类[4]。随着有关抗生素引起肝毒性的报道越来越多，人们不仅关注抗生素对人类的肝脏毒性，也开始关注抗生素对动物的肝毒性。近年来，已有多种抗生素被报道能够引发动物的肝毒性[5]，这其中就包括氟苯尼考。氟苯尼考是一种广谱的动物抗生素[6]，其具有很好的抗菌作用，对多种革兰阴性菌和阳性菌有抗菌作用。据报道，高剂量的氟苯尼考可通过抑菌作用加重肝损伤。本实验室前期研究也发现，1日龄开始给与氟苯尼考能显著抑制雏鸡早期的增重，损伤雏鸡的造血功能，同时对雏鸡的肝脏功能造成损伤[7]。

丹参多糖是丹参药材中重要药效成分之一。现代研究发现，植物多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、免疫调节、降血糖及降血脂等作用。丹参多糖作为植物多糖的一种也具有以上药效活性[8]。近年来，有多篇报道丹参多糖对肝脏损伤有较好的缓解作用，姚莹华等[9]发现，丹参多糖能降低LPS诱导的急性肝损伤模型小鼠肝组织中MDA含量，升高GSH含量，降低血清ALT含量，从而达到缓解肝脏损伤的作用；卢艳娴等[10]研究发现，丹参多糖通过开放肝窦内皮细胞窗孔，改善肝窦微循环，达到保护肝脏的作用。本实验室对丹参多糖的保肝效果进行了研究，前期研究发现，丹参多糖在体内外均能有效抑制炎症反应，并通过减少炎性因子的释放达到缓解免疫性肝损伤的效果[11-12]；丹参多糖还可以通过抑制炎症通路TRL4/MyD88[13]、NF-κB和趋化因子CXCL-10[14-15]的活性来降低炎症因子的释放达到抑制炎症反应的作用，进而缓解免疫性肝损伤。此外，丹参多糖能有效调控免疫性肝损伤的小鼠肝脏内氧化应激[15-16]，抑制肝细胞凋亡[17]，进而缓解肝损伤。同时发现，丹参多糖对CCL4引起的雏鸡肝脏损伤也有较好的缓解效果，丹参多糖能提高肝脏内肝药酶活性，降低肝细胞的氧化应激而保护肝脏细胞[18]。综上所述，丹参多糖对多种类型的肝损伤均有不错的缓解效果，具备开发成保肝药物的潜质。本试验以肉鸡为试验对象，阐明丹参多糖对氟苯尼考导致的肉鸡肝毒性的作用效果，这对中药有效成分的开发、阐明抗生素毒副作用和寻求有效防治措施具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂1日龄罗斯308肉鸡，购自河北大午公司；氟苯尼考溶液购自山东德州神牛药业有限公司；谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等生化试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；CYP1A1和CYP2H1 ELISA试剂盒，购自上海恒远生物技术有限公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒等，购自北京普洛麦格生物技术有限公司。

1.2 试验分组40只1日龄的罗斯308肉鸡被随机分成A、B、C、D 4组，每组10只，A组雏鸡从1日龄开始正常饮水和饲喂饲料；B组雏鸡从1日龄开始往饮用水中添加0.15 g/L(兽药典推荐剂量)的氟苯尼考(FFC)，连用5 d;C组雏鸡从1日龄开始分别往饮用水中添加0.15 g/L(兽药典推荐剂量)的氟苯尼考(FFC)和5.00 g/L的丹参多糖(SMPs)，连用5 d;D组雏鸡从1日龄开始往饮用水中添加5.00 g/L的丹参多糖(SMPs)，连用5 d。5 d后，各组雏鸡自由饮用自来水，正常饲喂饲料；饲养至42日龄，试验鸡翅下静脉采血，并处死采取鸡的肝脏。

1.3 测定增重、肝脏指数及料肉比各组1日龄雏鸡记录初始体质量，饲喂到42日龄后再次对各组肉鸡称重，然后计算两者差值作为各组雏鸡的体质量增加量；并在各组随机选取10只肉鸡处死，摘取其肝脏称重计算肝指数，肝指数=肝脏质量(g)/体质量(g)×100%。并计算整个饲养期各组的料肉比，料肉比=每组肉鸡总消耗饲料量(kg)/每组肉鸡总增重(kg)。

1.4 鸡全血中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(RGB)和血小板(PLT)的含量测定采取各组42日龄鸡血液置于抗凝管，将血液与抗凝剂充分混合，利用全自动血液细胞计数仪检测全血中WBC、RBC、RGB和PLT的含量。

1.5 检测雏鸡血清中ALT、AST、MDA、NO、SOD和CAT的含量采取各组鸡血液置于促凝管，将其倾斜置于4℃冰箱1 h，然后低速离心分离得到血清。利用分光光度计测定D值，并计算各组雏鸡血清中ALT、AST、MDA、NO、SOD和CAT的含量。

1.6 ELISA检测肝组织中CYP1A1和 CYP2H1的含量将各组肉鸡肝脏组织制作成10%的组织匀浆，离心后取上清液,用ELISA试剂盒检测肝组织匀浆上清液中CYP1A1和CYP2H1的含量。

1.7 RT-QPCR检测肝组织内CYP1A1 mRNA的转录水平使用总RNA提取试剂盒(Promega，Beijing，China)从肝脏中提取RNA，逆转录得到cDNA。通过实时定量荧光PCR方法检测肝脏中CYP1A1、CYP2H1、UGT2A1、GSTT1、Nrf2、HO-1、NQO-1、P53、CytC、Caspase-3 mRNA转录水平。引物由TaKaRa(大连，中国)设计合成(表1)。预变性处理为95℃ 120 s，扩增进行45个循环，包括95℃ 5 s，64℃ 30 s；然后72℃ 30 s。内参基因为β-actin，由2-ΔΔCt计算每个基因的相对转录水平。

表1 引物序列

2 结果

2.1 氟苯尼考对肉鸡增重的影响由表2可知，与空白组相比，0.15 g/L的氟苯尼考能引起雏鸡增重显著下降、肝指数的显著升高(P<0.05)；还能增加肉鸡饲养过程中的料肉比；而与氟苯尼考组相比，5.00 g/L 的丹参多糖能显著提高肉鸡的增重(P<0.05)，显著抑制肉鸡肝脏指数的增高(P<0.05)，降低肉鸡饲养过程中的料肉比。

表2 各组雏鸡平均增重、肝脏指数和料肉比

2.2 不同剂量氟苯尼考对鸡全血中WBC、RBC、RGB和PLT含量的影响由表3可知，与空白组相比，氟苯尼考均会导致肉鸡血液中RBC的数量和RGB的含量显著降低(P<0.05)，肉鸡血液中WBC数量和PLT含量却无显著改变(P>0.05)。而丹参多糖能显著缓解氟苯尼考导致的肉鸡血液中RBC的数量和RGB含量的降低(P<0.05)。

表3 全血中各成分的计数

2.3 丹参多糖对鸡血清中生化指标含量的影响检测肉鸡血清中生化指标发现，氟苯尼考组鸡血清中MDA和NO 的含量均显著高于空白对照组血清中MDA和NO的含量(P<0.05)，氟苯尼考组鸡血清中CAT显著低于空白对照组鸡血清中CAT的含量(P<0.05)；而用丹参多糖处理后能显著缓解氟苯尼考导致的肉鸡血清中MDA和NO含量的升高和CAT含量的下降(P<0.05)。各组肉鸡血清中ALT、AST和SOD的含量却没有显著差异(P>0.05)，结果详见表4。

表4 各组肉鸡血清中生化指标的含量

2.4 丹参多糖对肉鸡肝脏内药物代谢酶表达的影响如图1A所示，与空白对照组组相比，氟苯尼考组肉鸡肝组织中CYP1A1含量及 mRNA的转录水平均显著下降(P<0.05)，而CYP2H1的含量及mRNA的转录水平却没有显著性差异(P>0.05)；另外，我们检测肝脏药物代谢Ⅱ相反应中关键酶GSTT1和UGT2A1 mRNA的转录水平，结果显示氟苯尼考能显著降低肉鸡肝组织中GSTT1 mRNA的转录水平(P<0.05)，而对UGT2A1 mRNA的转录水平没有显著影响(P>0.05)；丹参多糖干预后，肉鸡肝组织中GSTT1 mRNA的转录水平显著升高(P<0.05)(图1B)。

A.各组雏鸡肝组织中CYP1A1和CYP2H1的含量；B.各组雏鸡肝组织中CYP1A1、CYP2H1、GSTT1和UGT2A1 mRNA的转录水平

2.5 丹参多糖对鸡肝组织中Nrf2 通路关键因子mRNA转录水平的影响如图2所示，与空白对照组相比，氟苯尼考能显著降低肝脏中Nrf2 mRNA转录水平(P<0.05);而与氟苯尼考组相比，5.00 g/L的丹参多糖能显著提高肝脏中Nrf2 mRNA转录水平和蛋白表达水平(P<0.05)；而HO-1和NQO-1 mRNA的转录水平在各组中均没有差异(P>0.05)。

图2 各组雏鸡肝组织中Nrf2、HO-1和NQO-1的mRNA的转录水平

3 讨论

据报道，正常推荐治疗剂量(0.15 g/L)氟苯尼考对7日龄以内肉鸡的生长性能、造血功能以及肝脏的功能均有一定的损伤作用[7]。而到42日龄时，正常推荐治疗剂量(0.15 g/L)的氟苯尼考仍显著抑制肉鸡的增重，而对造血功能和肝脏的功能损伤有所减轻。

本试验结果表明，42日龄时，丹参多糖对氟苯尼考导致的肉鸡生长抑制、肝脏功能损伤均有极好的缓解作用，基本恢复正常水平。

越来越多的证据表明，氧化应激在药物性肝损伤中扮演重要角色。肝脏是机体重要的代谢器官，肝脏内形成很多的抗氧化系统，能够在正常情况下维持肝脏的代谢。但过量的ROS会导致肝脏的抗氧化系统紊乱，造成氧化损伤[19-20]。为了检测丹参多糖是否通过抑制肝细胞的氧化应激来缓解肝脏的损伤，本试验检测了氧化应激的标志物MDA、NO以及关键抗氧化酶SOD、CAT含量，结果显示FFC诱导后，MDA、NO含量明显地升高，说明机体内还存在一定的氧化应激；而丹参多糖干预后，肉鸡肝组织中MDA和NO含量的下降表明机体的应激防御功能被激活，进而缓解肉鸡肝细胞损伤。据报道，Nrf2信号通路作为协调因子，在抗氧化应激系统中起到重要的作用[21]。其通过诱导调控细胞内Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的组成型和诱导型表达，有利于改善机体氧化应激状态，促进细胞存活以及维持细胞的氧化还原稳态[22-23]。而本试验结果表明，丹参多糖通过激活Nrf2及其下游蛋白的表达，改善了氟苯尼考诱导的肉鸡药物性肝损伤。此外，Nrf2作为氧化应激中的关键分子，可以调控下游HO-1和NQO-1等蛋白的表达，在调节细胞内脂肪积累中起到重要的作用[24-25]，本试验结果发现丹参多糖能够提高HO-1和NQO-1的表达水平，说明SMPs有增强细胞抗氧化的能力并能调控肝细胞的脂肪代谢。

药物本身或代谢产物的直接肝细胞损伤，导致肉鸡肝损伤最常见的就是抗生素、黄曲霉毒素、重金属等，它们的代谢产物大多都具有肝毒性[26]。药物在肝脏中需进行两步反应，即Ⅰ相和Ⅱ相反应。Ⅰ相反应:将药物进行水解、氧化、还原，产生代谢产物，主要的代谢酶是细胞色素 P450(CYP)，CYP1A1 及 CYP2H1 等都是导致药物性肝损伤相关的关键性氧化酶[27]。因此，肝细胞内肝药酶的含量对肝脏的解毒能力有直接的关系。我们的研究结果发现：42日龄时，氟苯尼考对肉鸡肝脏内肝药酶的活性仍有一定的抑制作用，而丹参多糖干预后能显著恢复肝脏内肝药酶的活性。在Ⅱ相反应中，谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferases，GSTs)是一组与肝脏解毒功能有关的酶，其谷胱甘肽和自由基结合，促进有毒物质从体内清除，降低药物潜在毒性，GSTs 功能障碍会导致急性肝损伤的发生[28]。当肝脏严重损伤时，GST 和 GSH 将从 肝细胞质中释放到血浆中，导致肝细胞质中GST 活性降低[29]。因此，临床上对肝组织中GSTs 活性水平的监测可能是诊断DILI 的潜在策略。我们的研究发现氟苯尼考能显著抑制GSTT1 mRNA转录水平，说明氟苯尼考能够抑制肝脏代谢药物的能力，造成大量的药物代谢物在肝脏中聚集，进而损伤肝脏的功能。而丹参多糖能够提高GSTT1的含量，恢复肝脏功能。除此之外，尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP glucuronosyl transferase，UGT)作为Ⅱ相反应中另外一个重要的转移酶，多项研究表示UGTs基因与药物性肝损伤具有显著相关性[30-31]。本研究发现各组肉鸡肝组织UGT2A1的表达没有显著差异。这可能是42日龄时，氟苯尼考对肉鸡肝脏功能损伤较轻微，没有引起尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶活性的显著改变。