不同党参炮制四君子汤对脾虚家兔治疗作用及机理探究

王忠清，杨显朝，刘 娟,2*

(1.西南大学 动物医学院，重庆 荣昌 402460；2.西南大学 免疫学研究中心，重庆 荣昌 402460；3.重庆市万州区茨竹乡农业服务中心，重庆 万州 404100)

现代集约化养殖方式使得畜禽活动受到严格限制，畜禽会因久卧或久坐而伤及脾胃，故脾虚证在动物生产中发病率较高。脾虚证主要表现为消化不良或腹泻，严重影响着畜禽的生产性能[1]。机体消化功能与胃肠激素的分泌有着密切联系[2]，胃肠激素中的胃泌素(gastrin,GAS)和胃动素(motilin,MTL)分别能通过刺激胃酸分泌和胃肠运动来促进胃肠消化吸收[3]。此外，脾虚证动物也会因为细胞免疫因子的分泌紊乱，继而出现免疫功能下降的现象[4-5]。研究表明，脾虚证家兔细胞免疫功能降低的原因可能与血液中T淋巴细胞比例下降有关[6]；而活化的T淋巴细胞所分泌的IL-2、IL-4、IFN-γ是维持机体细胞免疫功能的重要因子[7]。而且环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)作为细胞内第二信使，cAMP/cGMP的平衡也对机体免疫调节和维持细胞能量代谢发挥着重要作用[8]。

前期研究发现，党参及其炮制品(米党参和蜜党参)均能有效治疗家兔脾虚证[9]。中兽医临床上治疗脾虚证，宜补脾益气，健脾利水；常采取中药复方治疗，如四君子汤(sijunzi decoction,SJZD)、六君子汤、理中汤等。为丰富党参炮制品的临床应用，我们制备了含党参的四君子汤(SJZD-Ⅰ)、含米党参的四君子汤(SJZD-Ⅱ)和含蜜党参的四君子汤(SJZD-Ⅲ)拟用于治疗动物脾虚证。本研究中，我们探讨了SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ对脾虚证家兔的疗效，并探究其对脾虚证家兔部分血液生理指标、料重比和血清中胃肠激素(GAS、MTL)、免疫因子(IL-2、IFN-γ、IL-4)、cAMP/cGMP水平的影响，为党参炮制品的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物50只健康家兔，体质量(1.5±0.3) kg，雌雄各半，由西南大学动物医学院动物实验中心提供。

1.2 试验药物党参(批号：150401)购自广州健泽药业有限公司，厚朴(批号：160301)、枳实(批号：160901)、麸炒白术(160701)、茯苓(批号：160301)购自成都仁济宏药业有限公司，大黄(批号：170301)、炙甘草(批号：170301)购自重庆众妙药业有限公司。

1.3 主要试剂兔IL-2、IL-4、IFN-γ、GAS、MTL、cAMP、cGMP等ELISA试剂盒(批号：201712)均购自厦门惠嘉生物科技有限公司。

1.4 药物制备

1.4.1厚朴三物汤的制备 参照文献[10]称取厚朴、枳实、大黄三味中药(3∶3∶2)，加水将厚朴、枳实浸泡40 min，大黄浸泡20 min；再将厚朴、枳实煎沸10 min，然后加大黄共煎10 min，过滤；加水再次煎沸10 min，过滤。合并2次滤液，于60℃浓缩至药液质量浓度为0.5 kg/mL，保存于4℃备用。

1.4.2党参炮制品及SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ的制备 取200 g大米至炒药锅中，中火加热至大米冒烟时，倒入1 000 g切制好的党参片，炒至大米呈老黄色，筛去米，放冷即得米党参。取250 g炼蜜加入适量沸水稀释，加入1 000 g党参片拌匀并焖透，置炒药锅中,文火加热并炒至棕黄色，不黏手时取出，放冷即得蜜党参。SJZD-Ⅰ的制备：称取党参、麸炒白术、茯苓、炙甘草(2∶2∶2∶1)四味药，加水浸泡30 min,煎煮3次，时间分别为2.0，1.5，1.0 h，合并3次滤液，浓缩至生药0.5 kg/mL，即得。同法分别将党参替换为米党参和蜜党参制备得到SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ药液，保存于4℃备用。

1.5 分组与处理将家兔适应性饲养7 d，随机分为对照组、模型组、SJZD-Ⅰ组、SJZD-Ⅱ组和SJZD-Ⅲ组，每组10只。模型组、SJZD-Ⅰ组、SJZD-Ⅱ组和SJZD-Ⅲ组家兔采用厚朴三物汤(按照5 mL/kg,2 d灌胃)加饥饱失常法(灌胃当日禁食，次日饲喂料不限量)建立家兔脾虚证模型，对照组家兔按照同样方法灌胃生理盐水。参照《中兽医诊断学》[11]，家兔表现有精神倦怠、采食量下降或食欲减退、粪便软或溏、舌色淡白、脉细弱等主要临床症状，说明家兔脾虚证模型成功建立。家兔脾虚证模型建立后，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组按照2 mL/kg/d分别灌胃SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ药液，对照组和模型组按照同样方法灌胃生理盐水，1次/d，连续灌胃5 d，自由饮食，末次给药后再观察2 d。

1.6 脾虚家兔疗效观察与料重比测定临床观察并记录家兔精神、采食、被毛、口舌及粪便等情况，根据文献资料[12]制定脾虚家兔临床症状评分标准(表1所示)，并参考《中兽医学》[13]和《中兽医内科学》[14]诊疗判定标准评价疗效(表2)。在造模成功后和治疗结束时，对家兔空腹称体质量并记录。

表1 家兔脾虚的临床症状评分标准

表2 家兔脾虚疗效判定标准

1.7 家兔部分血液生理指标、胃肠激素、细胞因子及cAMP/cGMP水平测定末次给药2 d后禁食不禁水8 h，采集家兔耳缘静脉血抗凝血样，检测RBC和Hb水平；采集凝血血样置4℃过夜，4 000 r/min离心10 min，吸取血清，严格参照酶联免疫(ELISA)法试剂盒说明书，测定血清中GAS、MTL、IL-2、IL-4、IFN-γ、cAMP和cGMP水平。

1.8 数据分析所有数据用SPSS 20.0统计软件处理，采用单因素方差分析和Duncan多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 不同党参炮制四君子汤对脾虚证家兔的临床治疗效果观察对照组家兔活动敏捷、皮毛光亮、饮食欲俱佳、粪便正常。模型组家兔出现反应迟钝，精神倦怠，饮食欲低下，体瘦毛焦，肚腹胀满，粪便稀软，舌苔嫩白，脉细弱等症状。与模型组比较，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔精神状况和饮食欲恢复正常，被毛、口舌、脉象及粪便形态基本恢复正常。各治疗组脾虚家兔的治疗结果详见表3。

表3 各治疗组脾虚证家兔疗效

2.2 不同党参炮制四君子汤对脾虚证家兔料重比及血液生理指标的影响如表4所示，与对照组比较，模型组家兔体质量下降，其平均日增重和料重比为负值，差异极显著(P<0.01)。与模型组比较，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔平均日增重增加，料重比为正值，差异极显著(P<0.01)。如图1所示，与对照组比较，模型组家兔血液中RBC和Hb含量均有降低的趋势，但差异不显著(P>0.05)；与模型组比较，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔血液中RBC和Hb含量有升高的趋势，其中SJZD-Ⅲ组家兔血液中Hb含量显著升高(P<0.05)。

图1 家兔部分血液生理指标变化

表4 家兔料重比变化

2.3 不同党参炮制四君子汤对脾虚证家兔胃肠激素的影响与对照组比较，模型组家兔血清中GAS水平降低，差异不显著(P>0.05)；MTL水平降低，差异极显著(P<0.01)。与模型组比较，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔血清中GAS水平均升高，差异显著(P<0.05)；SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔血清中MTL水平均升高，差异极显著(P<0.01)，见图2。

图2 家兔血清中GAS、MTL水平变化

2.4 不同党参炮制四君子汤对脾虚证家兔血清IL-2、IL-4、IFN-γ的影响与对照组比较，模型组家兔血清中IL-2、IFN-γ水平极显著降低(P<0.01)，IL-4水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔血清IL-2、IFN-γ水平均极显著升高(P<0.01)，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔血清中IL-4水平有降低的趋势，其中SJZD-Ⅱ组家兔血清中IL-4水平显著降低(P<0.05)，见图3。

图3 家兔血清中IL-2、IL-4，IFN-γ水平变化

2.5 不同党参炮制四君子汤对脾虚证家兔血清cAMP、cGMP水平及cAMP/cGMP的影响与对照组比较，模型组家兔血清cAMP水平、cAMP/cGMP比值均极显著降低(P<0.01)，cGMP水平极显著升高(P<0.01)。与模型组比较，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔血清cAMP水平、cAMP/cGMP比值均极显著升高(P<0.01)，SJZD-Ⅰ、SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔血清中cGMP水平均有降低的趋势，SJZD-Ⅱ和SJZD-Ⅲ组家兔血清中cGMP水平分别极显著和显著降低(P<0.01和P<0.05)，见图4。

图4 家兔血清中cAMP、cGMP水平及其比值变化

3 讨论

研究表明，四君子汤能通过改善肠道菌群的多样性调理脾虚证[15]。经典四君子汤和兽用四君子汤的君药分别为人参和党参，而人参和党参都归脾、肺二经，能补脾益气，提高机体免疫力。中药炮制的目的主要是加强药物功效，减轻毒性或副作用。蜜炙的方法多用于炮制止咳平喘，补脾益气的药材；米炒的炮制方法能缓和党参燥性，用于治疗脾胃虚弱等证候[16]。本研究表明，含党参、米党参和蜜党参的四君子汤对家兔脾虚证的治愈率分别达到了80%，80%，90%，说明不同党参炮制四君子汤均对动物脾虚证有较好的疗效，其中以含蜜党参的四君子汤效果最佳，推测党参经过蜜炙后其补中益气作用得以增强。

中医“脾”的功能主要以消化为主，消化系统功能的异常是脾虚证最基本的病理变化。在消化过程中，GAS能刺激消化液分泌，促进胃窦收缩；MTL则刺激胃蛋白酶分泌，促进胃肠运动。研究表明，脾虚证动物血清中GAS、MTL水平明显低于正常动物[17]；高云芳等[18]研究结果提示，四君子汤可能通过促进胃液分泌而提高胃泌素的分泌水平。本研究结果表明，脾虚证家兔血清中GAS、MTL水平降低，体质量减少；而不同党参炮制四君子汤均能提高脾虚证家兔血清中GAS、MTL水平，促进体质量增加，说明不同党参炮制四君子汤均能增强脾虚证动物胃肠道消化功能。本研究结果提示，四君子汤中米党参和蜜党参相比党参组方更能促进胃肠消化吸收。

中医古籍记载“中焦受气取汁，变化而赤，是谓血”，当中焦脾胃虚弱时，则不能运化水谷精微，血液化源不足，导致出现如贫血、口色淡白等血虚之症。机体血液中RBC、Hb水平可作为评价脾虚证的稳定性指标[19]。本研究表明，脾虚证家兔血液中RBC和Hb水平有降低的趋势，与曹立亭等[20]研究报道结果基本一致；而不同党参炮制四君子汤均能提高血液中RBC和Hb水平。血液中RBC的增加是贫血恢复的指征，说明不同党参炮制四君子汤均发挥了补脾益气的效果。血红蛋白水平的增高是机体免疫力提高的表现[21]，提示不同党参炮制四君子汤均能增强脾虚动物的免疫功能。

“四季脾旺不受邪”的论述亦表明脾虚证动物的免疫功能低下[22]。现代医学研究认为，脾脏的免疫功能与体液免疫和细胞免疫有一定相关性，且还与多种细胞因子相关[23]。IL-2、IFN-γ和IL-4等免疫因子可由活化的T淋巴细胞分泌，参与机体广泛的免疫调节。IL-2能促进T淋巴细胞增殖，增强CD8+T细胞和NK细胞活性；IFN-γ能上调MHC分子表达，增强抗原呈递能力；IL-4能促进B淋巴细胞增殖以及产生抗体[24]。研究认为，脾虚证动物免疫功能低下主要是以细胞免疫因子的活性降低和紊乱为主[4]。本研究表明，脾虚证家兔血清中IL-2、IFN-γ水平显著降低，IL-4水平显著升高，说明脾虚证家兔免疫功能出现紊乱，导致IL-2、IFN-γ、IL-4水平异常变化，与文献[25]结果一致。不同党参炮制四君子汤均能提高家兔血清中IL-2、IFN-γ水平，降低IL-4水平，推测不同党参炮制四君子汤可能通过调节T淋巴细胞活性，增强脾虚证动物免疫功能。

环磷酸腺苷蛋白激酶(cyclic adenosine monophosphate-protein kinase A,cAMP-PKA)信号传导通路是物质能量代谢的主要细胞传导通路，该通路的激活为细胞代谢输送能量。研究表明，cAMP-PKA通路在脾虚证的过程中被激活[26]。有学者认为cAMP/cGMP在细胞代谢及免疫反应过程中发挥关键作用，cAMP/cGMP的比值升高利于机体免疫功能增强；且两者具有明显的拮抗性，与阴阳对立、消长十分相似[27]。魏彦明等[6]认为，cAMP/cGMP具有免疫调节作用，当cAMP升高而cGMP降低时，巨噬细胞的功能最强；cAMP还能增强干扰素的活性。本试验结果显示，脾虚证家兔血清中cAMP水平和cAMP/cGMP比值显著降低，而cGMP的水平显著升高，与文献[28]结果一致。推测脾虚动物因cAMP、cGMP分泌紊乱，导致了水谷运化不畅，细胞能量转化受阻，免疫功能降低。经不同党参炮制四君子汤治疗后，脾虚家兔血清中cAMP水平和cAMP/cGMP比值均显著升高，cGMP的水平降低，cAMP、cGMP水平趋于平衡，说明不同党参炮制四君子汤均能通过调节机体细胞信号传导通路来增强免疫，达到阴平阳秘的作用。