低剂量多巴胺对藏鸡肾脏钠氯共转运体穿梭的调节

李善政，叶幼荣，张笑冰，常振宇

(西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000)

藏鸡是高海拔地区经过长期自然选择和人工驯养的原始地方鸡种，也是世界上在高海拔生活历史最久的鸡种[1]。钠氯同向转运体(Na-Clcotransporter，NCC)是肾脏的一个协同转运蛋白，主要在动物肾脏远曲小管细胞内发挥作用，具有重吸收Na+和Cl-的功能[2-4]。肾脏远曲小管(distal convoluted tubule，DCT)根据不同的功能分为2段，分别为DCT1段和DCT2段，NCC遍布于整段DCT1[5]，是远曲小管重吸收钠的重要通道蛋白。钠离子从上皮细胞转运至组织间液的过程需要借助于 DCT1 段顶质膜的 NCC 和基底外侧膜的Na+-K+-ATPase才能完成[6-7]。研究表明，人类、家兔、鸡、鼠和鳗鱼的肾脏都有NCC的存在[8-10]。噻嗪类利尿剂主要通过抑制肾脏远曲小管靶蛋白NCC的表达从而使小管液中的钠离子浓度升高，水的重吸收降低，发挥利尿的作用[11-13]，而NCC对压力性利尿具有决定性作用[14]。多巴胺(dopamine，DA)作为神经递质，主要调节中枢神经系统内神经元之间的信息传递[15]。有研究表明：多巴胺作为利尿利钠激素[16]，可以控制肾小管绝大部分Na+的重吸收，被广泛用于各种相关病症的治疗，如心力衰竭、高血压及顽固性腹水等[17]。低剂量多巴胺对藏鸡肾脏NCC穿梭的调节目前尚未见报道。本试验给藏鸡低剂量注射左旋多巴胺后，检测NCC蛋白和mRNA在肾脏中表达的变化，以期为多巴胺调控藏鸡水盐代谢的机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物1日龄健康藏鸡50只(购自西藏林芝市某养鸡场)，雌雄各半，按常规饲养条件饲养，环境温度10～20℃、湿度55%～65%，自由采食和饮水，给予24 h 光照。饲养至28日龄，随机分为2组。试验组采用输液泵持续静脉注射低剂量左旋多巴胺，对照组用相同剂量生理盐水代替，注射时间均为4 h。

1.2 试验方法将左旋多巴按2～5 μg·kg-1·min-1的剂量用生理盐水稀释，输液泵以匀速模式，速度为2 mL/h持续向静脉加注，采取鸡的翅下静脉注射，注射完成做好记录。

1.2.1血清生化指标及mPAP检测 2组藏鸡经多巴胺和生理盐水处理后，剪开腹部，寻找腹主动脉，抽取约 5 mL 动脉血于离心管中，1 000 r/min离心30 min，吸取上清于无菌 EP 管中，用便携式血气分析仪(江苏南分)测定血清中血钠、血钾、血氯，尿素氮、肌酐等指标的变化。

鸡只在试验前 5 h 内禁食，对左股内侧进行局部麻醉，仰卧保定于操作台上，剥离左侧股动脉，远心端结扎，近心端用止血钳夹住，开一小口，沿近心端缓慢插入含有3.8% 柠檬酸钠的导管，然后结扎血管，松开止血钳，压力信号由传感器传输给多导仪，观察压力曲线，记录压力值。

1.2.2免疫组化检测NCC蛋白的表达 腹主动脉取血后，分离肾脏并充分冲洗，待肾脏颜色变白后用4%甲醛溶液固定保存。肾组织经包埋切片后，H2O2孵育，微波法热修复抗原，常规血清封闭，按照常规免疫组化方法，依次滴加一抗(兔抗鼠NCC抗体)、二抗(山羊抗兔 HRP-IgG)、SABC复合物，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗，DAB 法显色、复染、脱水透明和封片，于显微境下观察不同组肾组织中NCC蛋白的表达。

1.2.3Western blot检测NCC蛋白的表达 取不同组藏鸡肾组织分别置于已预冷的裂解液和PMSF抑制剂中，组织匀浆，提取细胞膜蛋白及胞浆蛋白，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min离心10 min。将上清转移至新的离心管中，用BCA试剂盒测定蛋白浓度及含量后加入上样缓冲液，变性10 min。每孔30 μL进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，滴加一抗(兔抗鼠NCC)，按1∶500用 TBST稀释，4℃过夜，TBST于室温下冲洗5 min×4次。山羊抗兔 HRP-IgG为二抗，按1∶5 000用 TBST稀释，37℃孵育2 h，TBST于室温下冲洗5 min×4次。膜上孵育1～2 min显色，放入凝胶成像仪中曝光成像，并利用Quantity One软件分析条带灰度值，目的蛋白与内参蛋白灰度值之比作为结果进行比较。

1.2.4RT-qPCR检测NCC mRNA的表达 采用常规TRIzol法提取不同组藏鸡肾组织总RNA，用核酸定量仪对RNA的纯度和浓度进行检测，将检测合格的 RNA反转录成cDNA，保存于-20℃。根据GenBank中NCC和GAPDH的mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物信息见表1。用Light Cycler 480 PCR仪(Roche公司)对NCC和内参基因β-actin的mRNA相对表达量进行检测。RT-qPCR反应体系20 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1 μL，2×Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应程序：95℃预变性15 min；95℃变性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40个循环。相对表达量采用2-ΔΔCt方法进行计算。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 藏鸡mPAP检测不同组藏鸡平均动脉压变化如图1所示，注射多巴胺后，藏鸡的mPAP有轻微波动，但与对照组相比，差异不显著(P>0.05)。

图1 平均动脉压变化

2.2 血清生化指标结果由表2可知，2组藏鸡血清中的钠、钾、氯、尿素氮以及肌酐等各项指标均未发生明显变化(P>0.05)。

表2 试验藏鸡血清生化指标的变化

2.3 免疫组化检测肾组织NCC表达2组藏鸡肾脏远曲小管顶质膜NCC免疫组化结果如图2所示，试验组和对照组肾脏远曲小管上皮细胞上显示出明显的棕黄色，阳性反应强，表明NCC在藏鸡肾脏远曲小管中有表达，其中细胞膜阳性表达较细胞质更强烈；空白组(不加一抗)无阳性反应显色。

A.空白组(不加一抗)；B.试验组；C.对照组

2.4 Western blot 检测肾组织NCC 表达结果由图3可知,静脉注射多巴胺后，NCC蛋白在远曲小管上皮细胞胞膜中的表达水平显著降低(P<0.05)，而细胞质中NCC蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。

A.细胞膜中NCC蛋白表达量；B.细胞质中NCC蛋白表达量

2.5 RT-qPCR检测肾组织NCC mRNA由图3可知，与对照组相比，静脉注射左旋多巴后，藏鸡肾脏中 NCC mRNA表达水平未发生显著变化(P>0.05)。

图4 藏鸡肾组织NCC mRNA表达水平

3 讨论

肾脏是调节和维持电解质、水盐代谢和酸碱平衡的重要器官[18]。肾脏远曲小管的生理功能是重吸收水分和钠离子，是机体内离子转运和分泌的关键场所，对血液中酸碱平衡的调节起着至关重要的作用。多巴胺可以通过促进肾脏血管扩张来调节肾血流量的增加，从而调节肾脏钠水的重吸收，促进利钠排尿，起到保护肾脏、调节血压的作用[19]。目前低剂量多巴胺已被广泛应用于心功能衰竭、肾功能衰竭及高血压等的治疗[17]。由于多巴胺的滥用，致使多巴胺的用途也饱受争议[20]。有相关研究表明，多巴胺不能在肾脏中直接合成，但可在肾脏血液循环中捕获左旋多巴经芳香左旋氨基酸脱羧酶(AADC)转化成多巴胺[21]。同时由于多巴胺在机体内代谢的半衰期短[22]，所以在设计给藏鸡输送小剂量多巴胺的试验时，采用的是静脉持续注射。另外，肾脏内转化生成的多巴胺不能发挥收缩血管的作用，只是单独调节水钠通道及干扰其他激素来实现肾脏对水盐的调节，发挥利钠排尿的作用[19]。多巴胺有类似血管加压素的功能，可调节NCC表达[23]。本试验通过免疫组化检测多巴胺组和对照组的藏鸡肾远曲小管NCC的表达，验证了以上结论。

血清中的尿素氮和肌酐都是体现肾功能的主要指标，肌酐主要是由肌肉组织产生的代谢废物，且主要通过肾脏排泄，可以体现肾小球的滤过功能[24]；尿素氮是一种含氮化合物，由肾小球滤过而排出体外[25]。本试验以血清尿素氮指标来辅助血肌酐指标，验证小剂量多巴胺对藏鸡肾小球滤过率的影响，通过检测发现，静脉注射多巴胺后，藏鸡血清中Na+、K+、Cl-、BUN和Cre等5项生化指标的变化差异不明显。以此间接验证了小剂量多巴胺不是通过调控肾小球滤过率，而是通过干扰肾小管的重吸收来达到利钠排尿的效果。

为进一步验证低剂量多巴胺对藏鸡肾脏利钠利尿的机制，本试验通过Western blot对肾脏远曲小管胞膜和胞质中NCC蛋白的差异表达进行了检测，发现注射多巴胺后，胞质中NCC的表达显著增多而胞膜中的表达显著减少。由此可揭示低剂量多巴胺主要通过调节NCC蛋白在远曲小管胞膜与胞质之间的穿梭从而降低肾脏对水重吸收的功能[26]。本试验还通过RT-qPCR检测了NCC mRNA的水平变化，与对照组藏鸡NCC mRNA相比，持续静脉注射左旋多巴胺的藏鸡NCC mRNA水平无明显变化，由此推测低剂量多巴胺有可能是通过调控NCC的磷酸化来促进NCC内化，从而减少了肾远曲小管对水的重吸收[27-28]。在藏鸡试验组持续注射小剂量多巴胺0.5 h后也发现，试验组藏鸡的粪便明显软化至水样，粪便中的尿量明显增多，推测出现此现象的原因为在多巴胺的影响下，NCC迅速内化转移至胞质，弱化了肾远曲小管的对钠水的重吸收，从而导致尿量增加[29-30]。

本试验给藏鸡静脉连续注射小剂量左旋多巴胺后，藏鸡的mPAP、血清生化指标以及NCC mRNA表达水平无显著性变化，但NCC蛋白在肾脏远曲小管细胞质中表达量高于细胞膜；推测多巴胺可能是通过诱导肾小管细胞膜NCC蛋白向胞内转移，瞬时调节NCC的穿梭，而不是通过长时调节来实现利钠利尿的功能。