高羊毛氨酸硒对幼龄比格犬抗氧化指标及狂犬病疫苗免疫效果的影响

郑谋凤，余紫薇，马田宁，祝徐航，姜 胜，宋泉江，周 彬，李 鼎，顾 垚，王晓杜，宋厚辉*，邵春艳*

(1.浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院，浙江 杭州 311300；2.浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300；3.动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室，浙江 杭州 311300；4.浙江农林大学 集贤学院，浙江 杭州 311300；5.英联贸易(上海)有限公司，上海 200051)

硒(selenium,Se)是人类和动物生命活动所必需的一种微量元素[1-3]。硒是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的重要组成成分，其参与清除机体新陈代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而维持了生物膜的完整性[4-7]。此外，研究显示硒能广泛提高机体免疫功能，如提高免疫系统细胞增殖，抗体合成和免疫细胞吞噬能力等[8-10]。膳食硒补充剂主要有2种形式：无机硒和有机硒，其中有机硒具有易吸收、毒性低和副作用小等特点而被广泛使用。高羊毛氨酸硒(selenohomolanthionine,SeHLan)是一种新型有机硒，使用产朊假丝酵母为菌株发酵亚硒酸钠，其生物利用度高于蛋氨酸硒[11-12]，目前已在家畜和家禽饲养中开始推广应用[13]。近年来，宠物营养和保健受到越来越多关注，但目前，在犬上，还未见有SeHLan相关的研究报道。本试验通过给幼犬接种狂犬病疫苗的同时，在基础日粮中添加不同剂量的SeHLan，检测各组犬的抗氧化指标和狂犬病抗体IgG滴度，以期为SeHLan的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物3月龄雄性比格犬25只(狂犬病抗原检测均为阴性)，体质量为(5.65 ± 0.13) kg，基础体检正常，已接种常规传染病疫苗，定期体内外驱虫，购于常州贝乐实验动物养殖有限公司(实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0007)。

1.2 主要试剂SeHLan(商品名：英特硒)由英国联合农业集团提供；犬猫狂犬病抗体检测试剂盒(批号：YJ096)购自法国辛百克斯公司；犬狂犬病疫苗购自硕腾动物保健品公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 试验设计比格犬随机分为5组，每组5只，分别为空白组(Ⅰ组)、疫苗组(Ⅱ组)和SeHLan添加组(Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组)。Ⅰ组仅饲喂基础日粮，Ⅱ组饲喂基础日粮并接种狂犬病疫苗；SeHLan添加组接种狂犬病疫苗的同时，在饲喂基础日粮的基础上添加不同剂量的SeHLan，添加剂量分别为Ⅲ组0.35 mg/kg、Ⅳ组1.00 mg/kg、Ⅴ组2.00 mg/kg按干物质添加(以硒计)。

1.4 试验日粮与饲养管理按照欧洲宠物食品工业联合会(FEDIAF)颁布的《猫和狗宠物食品的营养指南》中犬健康成长营养标准规范给予基础日粮，保证每只比格犬每天摄入的能量不低于397.5 kJ/kg[14-15]。基础日粮送检浙江省国正检测技术有限公司。基础日粮配方和营养成分见表1。SeHLan按照剂量与日粮彻底混合后再饲喂给比格犬，每日早、中、晚各饲喂1次，自由饮水，试验期间室内温度维持在20～ 25℃。

表1 基础日粮组成及营养水平(干物质基础) %

1.5 样品采集疫苗组和SeHLan添加组犬接种狂犬病疫苗，空白组犬注射同等体积的生理盐水。接种狂犬病疫苗当天记为0 d，SeHLan添加组比格犬日粮中开始添加SeHLan。分别在免疫后0，3，7，14，21，28,35 d从犬的前肢头静脉采血，分离血清-20℃保存，用于后续试验中犬血清硒、抗氧化指标(GSH-Px、SOD和MDA)和狂犬病抗体IgG滴度的测定。

1.6 样品测定犬血清抗氧化指标(GSH-Px、SOD和MDA)的检测方法根据各检测试剂盒说明书进行操作；血清硒含量依据WS/T 109—1999标准方法进行测定(浙江省国正检测技术有限公司)；狂犬病抗体IgG滴度根据SerelisaTM狂犬病抗体检测试剂盒(SYNBIOTICS)操作说明进行测定，判定标准：若抗体滴度≥0.6 IU/mL，说明该抗体水平对狂犬病病毒具有保护力，若抗体滴度<0.6 IU/mL，说明该抗体水平对狂犬病病毒不具有保护力。

2 结果

2.1 不同剂量SeHLan对比格犬血清硒含量的影响由图1可知，空白组和疫苗组比格犬血清硒含量在试验周期呈上升趋势，且呈显著性差异(P<0.05)，但升高幅度较小。SeHLan添加组犬血清硒含量在免疫后3 d后开始升高，与空白组相比差异显著(P<0.05)，且随着SeHLan添加剂量的增加，血清硒含量也逐渐升高。

注：有相同大写或小写字母表示差异不显著(P>0.05)；字母相同而大小写不同表示差异显著(P<0.05)；无相同字母表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.2 不同剂量SeHLan对比格犬血清抗氧化指标的影响由表2可知，空白组和疫苗组犬血清GSH-Px活性在整个试验期内保持稳定，SeHLan添加组犬在饲喂SeHLan 1周后，血清GSH-Px活性即开始显著增强，且随SeHLan添加量的增加而增强，差异极显著(P<0.01)，在饲喂SeHLan 1个月后，SeHLan添加组犬血清GSH-Px活性可以达到空白组的2倍。

表2 不同剂量SeHLan对比格犬血清中GSH-Px活性的影响 U/mL

由表3可知，在试验周期内，空白组犬血清SOD活性基本保持稳定。疫苗组犬血清SOD活性在试验开始后逐渐上升，在免疫后14 d左右达到高峰，之后逐渐下降至与空白组犬血清SOD活性相当。在整个试验期间，SeHLan添加组犬血清SOD活性均高于空白组，且差异极显著(P<0.01)，在免疫后21 d左右到达高峰，之后开始逐渐下降并稳定。在试验结束时，SeHLan添加组犬血清SOD含量仍显著高于空白组和疫苗组(P<0.05)。

表3 不同剂量SeHLan对比格犬血清中SOD活性的影响 U/mL

由表4可知，空白组犬血清MDA含量在试验开始7 d内保持稳定，之后开始缓慢下降，从免疫后21 d开始急剧下降。疫苗组犬血清MDA含量在整个试验期间也呈逐渐下降趋势，并在免疫后14 d开始与空白组相比差异极显著(P<0.01)。SeHLan添加组犬血清MDA含量在免疫后3 d即开始降低，差异极显著(P<0.01)，在整个试验期间其下降幅度均高于同期空白组和疫苗组，差异极显著(P<0.01)。其中SeHLan添加组(1.00 mg/kg)下降幅度最大，其他2个剂量组(0.35，2.00 mg/kg)之间差异不显著(P>0.05)。

表4 不同剂量SeHLan对比格犬血清中MDA含量的影响 μmoL/L

2.3 不同剂量SeHLan对比格犬狂犬病抗体IgG滴度的影响由图2可知，空白组比格犬狂犬病抗体IgG滴度在整个试验周期内均维持在基础水平，疫苗组和SeHLan添加组比格犬狂犬病抗体IgG滴度于免疫后3 d开始上升，在免疫后14 d达到峰值并维持2周左右后缓慢下降。其中，SeHLan添加组(1.00 mg/kg)狂犬病IgG抗体滴度从免疫后7 d开始均显著高于同期疫苗组(P<0.05)，且免疫后7 d抗体滴度已与疫苗组免疫后14 d相当，说明日粮中添加SeHLan(1.00 mg/kg)可以显著增强狂犬病疫苗免疫效果。

图2 不同剂量SeHLan对比格犬狂犬病抗体IgG滴度的影响

3 讨论

动物血清硒含量取决于食物中硒的含量，研究显示，犬血清硒浓度对食物中硒含量变化的反应最为敏感，可作为犬体内硒含量的一种生物标志物[14,16]。在本研究中，空白组和疫苗组比格犬仅饲喂基础日粮，随着比格犬日龄增长，体质量不断增加，每日摄取的基础日粮也在增加，基础日粮中硒含量为0.06 mg/kg，所以这2组比格犬血清硒含量也呈逐渐上升趋势，但其上升幅度平缓。SeHLan添加组在基础日粮中添加SeHLan后1周内，血清硒含量即开始升高，且犬血清硒含量与添加的SeHLan呈剂量依赖关系。研究显示，日粮中添加硒可提高马血浆硒水平，且有机硒比无机硒的效果更为明显[17-18]。

GSH-Px是抗氧化系统的重要成员，反映了机体抗氧化能力。硒是GSH-Px的活性中心，硒的状态直接影响此酶的活性。本研究表明在比格犬日粮中添加一定量的SeHLan可显著增强犬血清GSH-Px活性，且血清GSH-Px活性随SeHLan添加量的增加而增强，差异极显著(P<0.01)。这一变化与血清硒含量变化一致，表明犬血清硒浓度和GSH-Px活性与SeHLan添加剂量均呈现剂量依赖性。

SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，是生物体内重要的抗氧化酶。在试验周期内，与空白组和免疫组相比，各SeHLan添加组犬血清SOD活性上升趋势更为明显。其中，SeHLan(0.35，2.00 mg/kg)添加组幼龄比格犬血清SOD活性在免疫后14 d开始呈下降趋势，而SeHLan(1.00 mg/kg)组犬血清SOD活性在免疫后21 d出现下降，说明日粮中1.00 mg/kg的SeHLan添加量可延长犬血清SOD活性的上升期。

生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为MDA，因而MDA含量可反映机体脂质过氧化的程度和细胞损伤的程度。本研究中，空白组和疫苗组犬血清MDA含量呈逐渐下降趋势，这可能与幼犬日龄增加，机体抵抗力不断增强有关。本试验周期内SeHLan添加组的犬血清MDA含量也有不同程度的降低，下降幅度均高于同期空白组和疫苗组。其中，日粮中1.00 mg/kg的SeHLan添加量对降低犬血清MDA含量影响更为有效。

硒缺乏可影响人类和家畜的先天性免疫和获得性免疫，如嗜中性粒细胞和巨噬细胞功能，淋巴细胞功能和抗体产生等[19-21]。研究显示，补充硒可提高成年马和马驹的体液免疫功能[22-23]。抗体IgG滴度的高低可反映犬的特异性免疫状态，在本试验中，在接种狂犬病疫苗的同时，日粮中添加SeHLan(1.00 mg/kg)组幼龄比格犬狂犬病抗体IgG滴度上升又高又快，与疫苗组差异显著(P<0.05)，但SeHLan添加组(0.35和2.00 mg/kg)幼龄比格犬狂犬病抗体IgG滴度与疫苗组相比，无显著性差异(P>0.05)，说明SeHLan可显著提高幼龄比格犬狂犬病抗体IgG滴度，但其效果与硒的添加剂量相关。REIS等[24]的相关研究显示，日粮中添加3.6 mg 亚硒酸钠可促进牛狂犬病中和抗体产生的持久性，但补充过量的硒可能导致免疫抑制，这与本试验结果类似。

张晋辉[25]通过研究不同硒源对猪肌肉硒沉积的影响，发现SeHLan比酵母硒(SeMet)和亚硒酸钠(SS)能更有效地整合到肌肉中，并且Se的肌肉沉积量会随着SeHLan的添加量增加而升高。这种剂量依赖性在有关富硒畜禽产品的研究中也有体现，在肉鸡试验中，0.40 mg/kg的SeHLan处理组肌肉硒含量比0.10 mg/kg处理组高出90%左右；在蛋鸡试验中，0.60 mg/kg SeHLan处理组鸡蛋中硒含量比0.30 mg/kg处理组至少高出20%[12]。研究证明，机体内硒的生物效应、氧自由基的含量与硒浓度三者之间的关系呈倒置Weinberg曲线型，即硒在低浓度范围内可以清除氧自由基，且清除效果随着硒浓度增大而增强[26]。当硒处于高浓度范围内时，硒催化产生ROS，且随硒浓度增大，ROS产生量增多，此时硒的生物效应表现为毒性效应。综合本试验可以看出，日粮中添加SeHLan对幼龄比格犬抗氧化指标和狂犬病疫苗免疫效果的影响与该硒的补充剂量密切相关，其中，犬血清SOD活力、犬血清MDA含量、狂犬病抗体IgG滴度三者与SeHLan添加剂量之间为非剂量依赖性，而犬血清硒浓度和GSH-Px活性与SeHLan添加剂量均呈现剂量依赖性。在呈现剂量依赖性情况下，2.00，1.00 mg/kg这2个SeHLan的添加量之间差异并不显著，但在生产过程中考虑到成本问题，1.00 mg/kg的SeHLan添加量最为合适。

本研究表明日粮中添加SeHLan可提高幼龄比格犬的抗氧化能力，具体表现为可显著提高血清中GSH-Px和SOD活性，显著降低血清中MDA含量。SeHLan可显著提高幼龄比格犬狂犬病抗体IgG滴度，且在添加剂量为1.00 mg/kg时作用最显著。综上所述，幼犬在日粮中添加1.00 mg/kg的SeHLan，可有助于提高犬的抗氧化能力与狂犬病疫苗免疫效果。