犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

柳方远，印春生，李双星，单 虎，才学鹏，刘业兵*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.青岛农业大学 动物医学院，山东 青岛 266109)

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种人畜共患原虫，在世界范围广泛分布，全球约有1/3的人口感染弓形虫[1]。据统计，弓形虫全球血清阳性率平均为25%～50%[2]。弓形虫可专性寄生于人和动物的有核细胞引起发病，孕妇感染弓形虫可以引起早产、流产、胎儿畸形[3]；免疫力正常的人群多为隐性感染，免疫功能低下的患者可能出现淋巴结病或眼部弓形虫病[4]，隐性感染个体再次感染，重新激活可导致致命的弓形虫脑炎、心肌炎和肺炎[5]；弓形虫感染同时也是艾滋病患者的死亡原因之一[6]。弓形虫的中间宿主有200多种动物，包括哺乳类、鸟类、鱼类、爬行类和人等[7]，为典型的多宿主寄生虫，猫科动物是其惟一的终末宿主[8]。犬不仅是弓形虫的中间宿主，也是该病最重要的传染源之一。目前，我国犬类的弓形虫感染较为普遍，感染率为3.94%～46.67%，在北方某些地区尤为严重[9]。随着家养犬的数量不断增多，人类与患病犬亲密接触，导致人感染弓形虫的比率逐年上升，对人和动物的健康造成极大的潜在威胁[10]。所以，对犬弓形虫病进行有效的诊断和监测，降低人感染弓形虫的几率具有重大意义。

目前，检测弓形虫感染的方法，包括分子生物学诊断和血清学诊断。常规的PCR方法可用于在感染的急性期进行检测，但由于血液中无法获得弓形虫DNA，因此在慢性病例中无法检测到感染[11]。血清学诊断为弓形虫病最常用的诊断方法，其中ELISA检测方法与其他血清学方法诊断弓形虫病相比，具有可重复、易自动化和标准化的特点，还可用于定性和定量检测[12]，因此受到广泛的关注。刚地弓形虫18 kDa亲环蛋白(Toxoplasmagondiicyclophilin ,TgCyP)是弓形虫速殖子的重要成分，在弓形虫的繁殖和缓殖子转变过程中起重要作用[13]。目前，还未见该蛋白作为诊断抗原建立检测方法的相关报道。本研究对刚地弓形虫TgCyP基因进行原核表达，并以纯化的重组TgCyP为包被抗原，建立弓形虫抗体间接ELISA检测方法，为犬弓形虫病的临床诊断奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料弓形虫Chinese Ⅰ虫株、Vero细胞、pET-32a原核表达载体均为本实验室保存，大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞均购自Solarbio公司。犬弓形虫标准阴阳性血清样品由吉林农科院曹莉莉惠赠，犬血清临床检测样品来自南京，狂犬病病毒(RABV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒(CAV)等阳性血清均为本实验室保存。

1.2 主要试剂Ex Taq DNA聚合酶、总RNA提取试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix购自TaKaRa公司，限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ、T4DNA 连接酶购自NEB公司，HRP标记的山羊抗犬二抗购自Invitrogen公司，DNA Marker和蛋白Marker购自大连宝生物公司，胶回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司，His标签蛋白纯化试剂盒、HRP标记的羊抗鼠二抗购自Beyotime公司。

1.3 目的基因的扩增与重组表达质粒的构建

1.3.1引物的设计与合成 根据GenBank中的TgCyP基因序列(XM_002369910.2)，利用Primer 5.0软件设计引物，引物由上海生工生物公司合成，设计的引物序列如表1。

表1 扩增TgCyP基因引物序列

1.3.2弓形虫RNA的提取及基因的扩增 将弓形虫接种到Vero细胞中培养，待虫体溢出后收集纯化弓形虫，利用总RNA提取试剂盒对弓形虫进行RNA提取。利用PrimeScriptTMRT Master Mix获得cDNA，以cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因，目的基因大小为1 035 bp。扩增条件为：94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 2 min；将扩增产物进行凝胶电泳鉴定，利用胶回收试剂盒回收。

1.3.3重组表达质粒的构建 将胶回收的目的基因与pET-32a表达载体同时用EcoRⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切，凝胶电泳后切胶回收目的基因和pET-32a载体，利用T4DNA酶进行连接，16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用含氨苄霉素的固体LB培养皿培养，挑取单菌落扩增后提质粒，进行PCR和双酶切鉴定，将鉴定正确的阳性重组质粒送至上海生工生物公司测序，并将测序鉴定正确的质粒命名为pET-32a-C18。

1.3.4TgCyP的表达及鉴定 将重组质粒pET-32a-C18转化到BL21感受态细胞中，挑取单菌落于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃ 200 r/min摇菌4～6 h，培养至D600 nm为0.6时加入IPTG继续培养8 h，诱导表达目的蛋白。离心收集菌体，用PBS重悬菌体进行超声裂解，裂解后10 000 r/min 离心5 min，分别收集上清和包涵体，包涵体用PBS重悬。SDS-PAGE电泳分析鉴定。

1.3.5TgCyP的纯化和Western blot鉴定 将大量诱导表达的蛋白按Beyotime His标签蛋白纯化试剂盒的纯化程序对目的蛋白进行纯化，得到纯化后的TgCyP，测定浓度。SDS-PAGE后，将重组蛋白质转至PVDF膜上，5%的脱脂乳37℃封闭1 h；洗膜后，加入1∶4 000稀释的抗His标签蛋白的鼠单克隆抗体，室温摇床孵育2 h；洗膜后再加入1∶5 000 稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，室温摇床孵育1 h；洗膜后曝光，观察结果。

1.4 弓形虫间接ELISA检测方法的建立

1.4.1最佳抗原包被质量浓度和血清稀释度的确定 采用方阵滴定法，用CBS(0.05 mol/L，pH 9.6)将TgCyP 按照4.000，2.000，1.000，0.500，0.250，0.125 mg/L 的质量浓度做横向两倍倍比稀释，100 μL/孔，每个梯度设置2个复孔，包被96孔酶标板，4℃过夜，PBST洗涤3次。用5%的脱脂乳封闭2 h，200 μL/孔，PBST洗涤3次。将1份阳性血清和阴性血清按1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600进行纵向梯度稀释，37℃作用1 h，PBST洗涤3次。然后加入1∶5 000稀释的HRP标记山羊抗犬二抗，每孔100 μL，37℃ 1 h，PBST洗涤3次。最后加入显色液和终止液，测量D450 nm值，计算P/N。判断标准：当D值接近1.0，P/N>2.1 时，对应的条件即为抗原最佳包被质量浓度和最适血清稀释度。

1.4.2反应条件的优化 在上述基础上对包被条件(4℃过夜、常温过夜、37℃ 3 h)，封闭液(5%BSA、5%脱脂乳)和封闭时间(30，60，90 min)，待检血清作用时间(30，60，90 min)，二抗稀释倍数(1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000，1∶10 000，1∶12 000)和作用时间(30，60，90 min)进行优化。测量D450 nm的值，当P/N最大时，所对应的条件即为最佳作用条件。

1.4.4重复性试验 分别做批间重复性试验和批内重复性试验。选择同一批次包被的3块酶标板和不同批次包被的3块酶标板，对3份阳性血清和3份阴性血清按照已经优化好的条件进行检测，并计算其平均值、标准差和变异系数。若变异系数<10%则重复性好。

1.4.5特异性试验 利用已优化的间接ELISA方法分别检测CPIV、RABV、CDV、CPV和CAV 阳性血清，设置弓形虫阳性和阴性对照血清，鉴定已建立的间接ELISA方法与犬其他病毒阳性血清是否发生交叉反应。

1.4.6敏感性试验 将5份弓形虫阳性血清各作1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800稀释，并设阳性、阴性、空白对照，然后用已建好的方法进行间接ELISA检测，根据确立的临界值判断该方法能检测出的犬弓形虫阳性血清的最小值，评价该方法的敏感性。

1.4.7临床样本检测与符合率试验 利用建立的间接ELISA方法与改良凝集试验(MAT)[14]，对采自南京地区的226份犬的血清样品进行检测，计算阳性率，比较2种方法的符合率。

2 结果

2.1 TgCyP基因的扩增以cDNA为模版，T-C18-F和T-C18-R为上、下游引物，扩增出TgCyP基因片段，如图1所示，目的基因大小为1 035 bp，与预期结果一致。

M.DL2000 DNA Marker;1.TgCyP基因RT-PCR产物

2.2 重组表达质粒pET-32a-C18的双酶切鉴定构建的重组质粒pET-32a-C18经EcoRⅠ和HindⅢ 双酶切得到约5 870与1 035 bp 2条片段，如图2所示，与预期大小一致，说明重组质粒构建成功。

M.DL10000 DNA Marker;1.pET-32a-C18双酶切产物;2.未经酶切的质粒

2.3 重组TgCyP蛋白的表达鉴定及Western blot分析将表达的重组TgCyP进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果如图3所示，在诱导菌的上清中出现明显的目的条带，相对分子质量大小为18 kDa，与预期相符，说明该目的蛋白在上清中大量表达，在包涵体中不表达。同时，为验证TgCyP蛋白的免疫反应性，对蛋白纯化后进行Western blot分析，结果如图4显示，纯化后的蛋白无明显杂带，能与鼠抗His标签一抗进行免疫印迹反应，在18 kDa处有特异性条带。

M.蛋白质相对分子质量Marker;1.重组蛋白上清;2.重组蛋白包涵体

A.SDS-PAGE(M.蛋白质相对分子质量Marker,1.纯化后的重组TgCyP蛋白)；B.Western blot(M.蛋白质相对分子质量Marker,2.重组蛋白反应条带)

2.4 间接ELISA条件优化结果

2.4.1最佳抗原包被质量浓度和血清稀释度的确定 采用方阵滴定法，进行间接ELISA检测。取P≥1.0且P/N>2.1，P接近1.0对应的D450 nm值，即为最佳抗原包被质量浓度和最适血清稀释度。检测结果如表2所示，最佳抗原包被质量浓度为1 mg/L，最适待检血清稀释度为1∶200。

表2 最佳抗原包被质量浓度和血清稀释度的确定

2.4.2反应条件的优化 在上述试验结果的基础上，以1 mg/L包被TgCyP，在1∶200血清稀释度下，对反应条件进行优化，根据P/N值的大小确定了最佳包被时间为4℃过夜；最适封闭条件为5%脱脂乳封闭2 h；最佳底物作用时间为60 min；酶标二抗最佳稀释度为1∶4 000，二抗作用时间为60 min。

表3 重复性试验(批间试验)

表4 重复性试验(批内试验)

2.4.5特异性试验 利用已优化的间接ELISA方法分别检测CPIV、RABA、CDV、CPV和CAV 阳性血清。结果如表5显示，用该检测方法检测犬弓形虫特异抗体时，不与犬其他病毒阳性血清发生交叉反应，特异性良好。

表5 特异性试验

2.4.6敏感性试验 为评估本研究方法的敏感性,将5份弓形虫阳性血清作1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800稀释进行检测。结果如表6显示，阳性血清在1∶6 400 时的D450 nm均大于临界值0.298，表明该检测方法敏感性较高。

表6 敏感性试验

2.4.7临床样本检测 应用本研究建立的方法，对采自南京地区的226份犬血清进行检测，结果发现该批犬血清中弓形虫抗体阳性率为24.34%(55/226)。将该结果与改良凝集试验MAT检测结果比较，两者的符合率为94.70%(67/226)，见表7。

表7 MAT和ELISA检测结果对比 份

3 讨论

弓形虫多为隐性感染，没有明显的临床症状，感染率高，危害严重，临床诊断相对困难，至今尚无有效的防治药物[15]。目前，针对犬弓形虫病尚无十分完善的快速诊断方法，标准的商业化试剂盒也较少。间接ELISA方法能在短时间内检测大量样本，且灵敏、特异，能满足临床诊断的需要[16]。在过去的研究中，许多重组抗原，包括棒状体蛋白ROP1、ROP2、ROP18、致密颗粒蛋白GRA3、GRA6、GRA7和GRA15[17]，表面抗原SAG1和SAG2，微线体蛋白MIC2、MIC3、MIC4和MIC5，以及基质蛋白MAG1等已在大肠杆菌或酵母中表达，并通过ELISA评估了其在弓形虫诊断方面的价值[18]。而弓形虫分泌的TgCyP作为细胞内和细胞间的信息传递介质[19]，还未见有相关研究利用该蛋白作为诊断抗原建立检测方法。

因此，在本研究中，我们重组表达了TgCyP，试验发现该蛋白可溶性好，表达量高，易提纯，是建立诊断方法的优秀抗原。之后利用构建好的重组TgCyP作为包被抗原，优化各项反应条件，建立了一种间接ELISA检测方法。通过一系列试验，确定抗原最佳包被质量浓度为1 mg/L，4℃包被过夜，5%脱脂乳封闭2 h，血清最适条件为1∶200稀释，二抗最适条件为1∶4 000稀释。建立的间接ELISA方法重复性良好，不与CPIV、CRV、CDV、CPV等犬其他血清发生交叉反应，敏感性可达1∶6 400，试验证明，该方法特异性较好，敏感稳定。

对226份犬的血清样品进行检测，间接ELISA方法共检测出55份弓形虫抗体阳性样品和171份阴性样品，这55份阳性样品均被MAT检测为阳性，在171份血清阴性样品中有12份MAT检测为阳性，两者的符合率为94.7%。建立的间接ELISA检测方法与金标准MAT符合率较高，差值较小，后期会进一步的完善。MAT试验中利用福尔马林固定抗原，被检血清用2-巯基乙醇处理，可去除非特异性抗体的干扰，但MAT反应需要大量的弓形虫速殖子，且反应时间长，不适合大批样本的检测。而本研究建立的间接ELISA方法，敏感性和特异性高，重复性强，操作简便，可快速检测大量样本。综上所述，本方法适合犬弓形虫的抗体检测，为弓形虫的流行病学调查奠定基础，为后续试剂盒的生产提供了技术参考。