eNOS/PKG-1通路在L-精氨酸抗野百合碱所致大鼠右心室重构中的作用

任星桥，李晓彤，林小英，曾凡群，李叶丽，杨丹莉

(遵义医科大学药学院，基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

右心室重构导致的心力衰竭是肺动脉高压患者死亡的主要原因之一[1]。目前认为右心室重构主要涉及心肌细胞肥大、凋亡、炎症、氧化应激及一氧化氮(nitric oxide，NO)缺乏等方面[2]。其中，内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化L-精氨酸(L-Arginine，L-arg)生成NO，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制剂NG-硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)可阻断上述反应。L-NAME是NOS的抑制剂，能够降低细胞内NO含量，诱导大鼠左心室肥厚[3]。eNOS的表达降低可引起NO生成减少，下游蛋白激酶G1(protein kinase G1，PKG-1)表达降低，使细胞内游离Ca2+浓度升高，导致血管收缩，心肌细胞肥大，促进心室重构的发生。PKG又称环磷酸鸟苷依赖型蛋白激酶，有PKG-1和PKG-2两种类型[4]，其中PKG-1主要分布于血管平滑肌细胞、心肌细胞的细胞质中，PKG-1可使肌球蛋白轻链去磷酸化，细胞内游离Ca2+浓度降低，产生舒张血管、抑制心肌细胞肥大等作用。野百合碱(monocrotaline，MCT)所致大鼠右心室重构模型，是目前常用于研究右心室重构的病理模型[5]。目前PKG-1在L-arg改善MCT所致右心室重构中的作用鲜有报道。本研究旨在借助工具药L-NAME，探讨eNOS/PKG-1通路在L-arg干预MCT所致大鼠右心室重构的作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.1.1药品 MCT(产品编号：C2401-1G，Sigma公司)；L-精氨酸(产品编号：HY-N0455，MCT公司)；L-NAME(产品编号：HY-18729A，MCT公司)。

1.1.2试剂 cTnI兔单克隆抗体(产品编号：ab209809，abcam公司)；eNOS小鼠单克隆抗体(产品编号：ab76198，abcam公司)；PKG-1兔单克隆抗体(产品编号：#3248，Cell Signaling公司)；GAPDH兔多克隆抗体(产品编号：10494-1-AP，Proteintech公司)；β-actin兔多克隆抗体(产品编号：AF7018，Affinity公司)；HRP标记山羊抗兔IgG(产品编号：S0001，Affinity公司)；HRP标记山羊抗小鼠IgG(产品编号：SA00001-1，Proteintech公司)。

1.2 仪器PowerLab/8SP生物监测仪(澳大利亚AD instruments公司)；BX43+DP2b正置显微镜及照相系统(日本Olympus公司)；5417R离心机(德国Eppendorf公司)；Supply Mini-Protean 3电泳仪(美国BIO-RAD公司)；Mini Trans-Blot转移系统(美国BIO-RAD公司)；ChemiDoc成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.3 实验动物及分组体质量(180-220) g，♂SD(Sprague Dawley，SD)大鼠20只，无特定病原体(specific pathogen-free animal)SPF级，购买于长沙天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2014-0011。适应性喂养1周，饲养条件：室温19℃-25℃，相对湿度40%-70%，将所有SD大鼠随机分为正常对照组(Control组)、模型组(MCT组)、L-精氨酸组(L-arg组，200 mg·kg-1)和L-精氨酸+L-NAME组(L-arg+L-NAME组，200、20 mg·kg-1)。除Control组，其余各组大鼠均采用颈背部一次性皮下注射MCT(55 mg·kg-1)，建立右心室重构模型，Control组大鼠颈背部一次性皮下注射等体积生理盐水作对照。造模14 d后开始给药，L-arg组和L-arg+L-NAME组大鼠每日腹腔注射L-arg，其中L-arg+L-NAME组大鼠每日灌胃L-NAME，Control组和MCT组大鼠每日灌胃等体积双蒸水，持续14 d。

1.4 血流动力学检测给药14 d后，采用右心导管术检测大鼠右心室压。大鼠称质量，剪开颈部右侧皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉，游离颈外右静脉。将连接压力传感器的导管慢慢推入右侧颈外静脉，经右心房插入右心室，记录右心室压力波形变化。

1.5 大鼠右心室质量指数的测定血流动力学检测后摘取心脏，迅速置于预冷的生理盐水中清洗，于冰上分离右心室游离壁，滤纸蘸干水分，称质量记录，计算右心室质量指数=右心室质量/体质量。

1.6 右心室形态学观察取大鼠右心室组织置于4%甲醛溶液中，固定48 h。脱水、石蜡包埋、制备组织切片，厚度约为3 μm，进行HE染色，中性树脂封片。自然晾干后，于Olympus正置显微镜下观察右心室病理学变化并拍照。

1.7 Western blot检测大鼠右心室cTnI、eNOS和PKG-1蛋白的表达称取大鼠右心室组织约50 mg剪碎，加入0.5 mL裂解液(RIPA裂解液 ∶PMSF溶液 ∶蛋白磷酸酶抑制剂=100 ∶1 ∶1)，使用眼科剪置于冰上剪碎，冰上静置裂解30 min后配平离心，条件：4 ℃、12 000 r·min-1、15 min，吸取上清液于-80 ℃冰箱保存。BCA法测定上清液的蛋白含量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶(上层5%浓缩胶，下层12%或8%分离胶)，蛋白样品经电泳分离后，使用半干转印槽转移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，7%脱脂牛奶摇床室温封闭约3 h，TBST洗去牛奶(每次10 min，共3次)，4 ℃过夜孵育一抗(>16 h)：cTnI(1 ∶2 500)、eNOS(1 ∶1 000)、PKG-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)、β-actin(1 ∶5 000)，TBST洗膜，室温孵育二抗(1 ∶5 000)约40 min、TBST洗膜后使用化学发光试剂(ECL)，于成像系统获取图像进行分析。

2 结果

2.1 L-arg对大鼠右心室最大压的影响给药14 d后，与Control组相比，MCT组大鼠右心室最大压明显升高(P<0.05)是Control组的1.74倍；与MCT组相比，L-arg组大鼠右心室最大压降低35.95%(P<0.05)；与L-arg组相比，L-arg+L-NAME组大鼠右心室最大压明显升高(P<0.05)，是L-arg组1.51倍。

Fig 1 Effect of L-arg on right ventricular max pressure in rats n=5)

2.2 L-arg对大鼠一般状况、体质量、右心室质量指数的影响给药14 d后观察，Control组大鼠毛色光泽、呼吸平稳、体质量逐渐增加；MCT组大鼠毛色发暗、呼吸急促、活动和进食减少、体质量逐渐减轻；L-arg组大鼠毛色较为光滑、呼吸较为平稳；L-arg+L-NAME组大鼠一般状况与MCT组大鼠一致。与Control组相比，MCT组大鼠体质量明显降低(P<0.05)，右心室质量指数明显升高(P<0.05)；与MCT组相比，L-arg组大鼠体质量明显增加(P<0.05)，右心室质量指数明显下降(P<0.05)；L-arg+L-NAME组大鼠相较于L-arg组右心室质量指数明显升高(P<0.05)，体质量明显下降(P<0.05)。

2.3 L-arg对大鼠右心室病理学的影响HE染色发现，Control组大鼠右心室无明显病理学损伤，其心肌细胞排列有序，细胞形态正常；MCT组大鼠右心室心肌细胞明显肥大且排列紊乱，伴随炎性细胞浸润；L-arg组大鼠右心室心肌细胞排列较为整齐，心肌细胞肥大有所改善；L-arg+L-NAME组大鼠右心室心肌细胞肥大，且排列紊乱，细胞间质出现肿胀，伴有炎性细胞浸润。

Tab 1 Effect of L-arg on body weight and right ventricular mass index in rats n=5)

Fig 2 Effect of L-arg on right ventricular morphology in ratsA：Control；B：MCT；C：L-arg；D：L-arg+L-NAME

2.4 L-arg对大鼠右心室cTnI蛋白表达的影响Western blot结果发现，与Control组相比，MCT组大鼠右心室cTnI蛋白表达明显上调，是Control组的1.15倍(P<0.05)。与MCT组相比，L-arg组大鼠右心室cTnI蛋白表达下调36.16%(P<0.05)，L-arg+L-NAME组大鼠右心室cTnI蛋白的表达与L-arg组相比上调36.44%(P<0.05)。

Fig 3 Effect of L-arg on the protein expression of cTnI in right ventricle of rats n=3)

2.5 L-arg对大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表达的影响Western blot结果发现，与Control组相比，MCT组大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表达分别下调41.83%、45.16%(P<0.05)。与MCT组相比，L-arg组大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白表达分别上调73.42%、56.56%(P<0.05)，L-arg+L-NAME组大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白的表达与L-arg组相比分别下调38.25%、40.97%(P<0.05)。

Fig 4 Effect of L-arg on the protein expression of eNOS and PKG-1 in right ventricle of rats n=3)

3 讨论

L-arg是一种人工合成的强效血管扩张剂，也是体内NO的供体，上调L-arg水平时，NO的生成增多[6]。研究表明，L-arg干预可改善冠状动脉左前降支结扎法诱导的大鼠急性心肌梗死[7]。MCT是一种吡咯烷生物碱，在肝脏内经P450单氧化酶转化为野百合碱吡咯[8]，破坏肺血管内皮细胞，引起肺血管不可逆性损伤，导致肺动脉压力升高，继发右心室重构，严重可发展为右心衰竭甚至死亡。目前常用皮下注射或腹腔注射MCT的方法[9]，制备研究肺动脉高压和右心室重构的病理模型。本研究借用工具药L-NAME，探讨eNOS/PKG-1通路在L-arg干预右心室重构中作用。

本研究结果显示，与Control组相比，MCT组大鼠体质量明显减轻；右心室最大压和右心室质量指数明显升高；心肌细胞出现肥大，且排列紊乱，伴有炎性细胞浸润，说明MCT组大鼠出现右心室重构，造模成功，与文献报道相符[10-11]。与MCT组相比，L-arg组大鼠体重明显增加；右心室最大压和右心室质量指数均明显降低；心肌细胞肥大、排列紊乱、炎性浸润均明显减轻，说明L-arg可改善MCT所致大鼠右心室重构。与L-arg组相比，L-arg+L-NAME组大鼠在右心室最大压、右心室质量指数、病理结果各方面变化趋势与MCT组相较一致，提示L-NAME作为NOS的抑制剂，可以逆转L-arg抗MCT所致右心室重构的作用。

心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)是一种心肌细胞的结构蛋白，由cTnT、cTnC和cTnI 3个亚基组成。正常情况下，胞质内游离的cTnI较少，当心肌细胞受损时，结合于心肌结构蛋白中的cTnI等亚基逐渐分解并通过受损的心肌细胞膜入血。因此，cTnI是公认的特异性心肌损伤标志物。临床通过检测血清中cTnI的含量以判断心肌损伤[12]。有文献报道，五味子醇甲通过下调心肌细胞cTnI蛋白的表达可改善去甲肾上腺素诱导的H9C2心肌细胞肥大[13]。本研究结果显示，与Control组相比，MCT组右心室组织cTnI蛋白表达上调；L-arg能抑制MCT所致的右心室组织cTnI蛋白表达的上调；而L-NAME作为eNOS的抑制剂能抑制L-arg的上述作用。结合L-arg可以抑制MCT引起的右心室肥大等结果，提示L-arg可能通过抑制cTnI亚基从心肌结构蛋白中解离从而抑制右心室重构。

在心肌细胞内，eNOS催化L-arg生成NO，NO可以活化可溶性鸟苷酸环化酶，生成环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)，继而激活PKG-1，产生舒张血管，抑制心肌细胞肥大等多种作用。本研究结果显示MCT组大鼠右心室eNOS和PKG-1蛋白的表达均下调。有研究发现在MCT诱导的大鼠右心室重构中，右心室eNOS的表达和/或PKG蛋白的表达下调[14-15]；朱鸣等[16]发现左心室重构的发生与缺乏PKG密切相关。综合以上分析，提示eNOS和PKG-1的表达被抑制与MCT所致大鼠右心室重构相关。有文献报道[17]，KMUP-1通过上调左心室组织eNOS蛋白的表达，使NO生成增多，继而cGMP生成增多、PKG-1蛋白的表达升高，从而改善异丙肾上腺素所诱导的大鼠左心室重构。本研究结果显示：L-arg作为eNOS的底物供体，能抑制MCT所致的右心室组织eNOS和PKG-1蛋白的表达下调；而L-NAME作为eNOS的抑制剂能抑制L-arg的上述作用。综合以上分析，L-arg可能通过增加eNOS的底物而促使NO生成增加，从而激活NO-cGMP-PKG信号通路；另一方面，L-arg还通过上调eNOS的表达，激活NO-cGMP-PKG信号通路，继而改善MCT所致的右心室重构。

综上所述，L-arg具有改善MCT所致大鼠右心室重构的作用，其机制可能与上调eNOS/PKG-1的信号通路有关。

(致谢：本实验在遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室完成！)