乳蛋白水解度检测方法研究进展

张湘渠，张 斌，盖丽娜，田泽晨，王一玮，张兰天

（河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050200）

母乳是婴幼儿最理想的营养来源[1]。母乳的致敏性极低，而且能够满足婴幼儿生长的营养需求，同时增强新生儿的免疫力。但当母乳无法满足婴幼儿需求时，需要选择其他营养物质来代替。牛乳因含有较丰富的蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等被人们选择，尤其是牛乳中的必需氨基酸和非必需氨基酸均为人体生长发育所需要的，消化率远远高于植物蛋白质，是完全蛋白质，因此以牛乳为原料的婴儿配方乳粉成为母乳的最佳替代品，但是有一部分婴幼儿食用后产生不适症状。近几年研究开发的水解蛋白配方食品替代普通乳粉，不仅可以有效缓解婴幼儿产生的不适症状，水解后的乳清蛋白还具有抗氧化等作用，水解蛋白配方食品的优势及其功能性普遍得到了消费者认可，市场也在不断扩大。目前国内水解蛋白配方食品还有较大的发展空间，质量安全问题成为此类产品技术改进、完善以及市场拓展的基础。本文总结婴幼儿摄入牛乳后产生不适症状的原因及现有的蛋白质水解度检测方法，为后续水解蛋白配方食品水解度检测方法的建立提供研究思路。

1 婴幼儿对牛乳过敏的原因

由于母乳与牛乳的组成成分存在差异，易引起部分婴幼儿产生过敏反应。牛乳中含有多种蛋白质，统称为牛乳蛋白，主要包括酪蛋白和乳清蛋白。牛乳中的酪蛋白主要为αs-酪蛋白，αs-酪蛋白使酪蛋白胶束粒子颗粒较大，而且沉淀时形成坚硬的凝块，影响婴幼儿的消化吸收。研究发现，对酪蛋白过敏的人中，对αs1-酪蛋白过敏占较大比例[2]，αs1-酪蛋白是酪蛋白中最主要的过敏原。母乳中不含有αs-酪蛋白，母乳中主要为β-酪蛋白，β-酪蛋白胶束粒子相对较小，且沉淀时为特别细微、分散的状态。另外有研究表明，超过80%对牛乳过敏的人对β-乳球蛋白过敏。鲜牛乳中的β-乳球蛋白通常以二聚体形式存在[3]，而母乳中不含有β-乳球蛋白，因此它也被认为是牛乳过敏的原因之一。

在通常情况下，αs-酪蛋白和β-乳球蛋白可以被人体消化吸收，对于婴幼儿来讲，由于自身消化能力不足，特别是0～6 个月的婴儿，内源性基因调控、外部环境抗原刺激、肠道及免疫系统没有发育完全，极易引起多种过敏现象[4-7]，如湿疹、皮炎、腹泻、便秘等。

鉴于此现象，许多婴幼儿乳粉厂家通过生产工艺降低β-乳球蛋白的比例，以减少出现过敏症状的概率，却大大增加了婴幼儿的肾脏负担，此方法已经不再提倡，同时国家对特殊医学生产许可标准审查规则重视度增加[8]。研究发现，通过特定的技术将牛乳中的大分子，如αs-酪蛋白和β-乳球蛋白，分解为分子质量较小的多肽时，致敏性也随之消失[9-10]。相比于普通的配方乳粉，乳蛋白水解配方食品具有致敏率低的特点，更适合肠道发育不完善的婴幼儿，在一定程度上降低了因对乳蛋白过敏患病的几率[11]。

2 乳蛋白水解配方食品的种类

乳蛋白水解配方食品是针对牛乳蛋白过敏的婴幼儿所研发的食品，水解后的乳清蛋白可以有效降低婴幼儿过敏反应的发病概率，将大分子蛋白质水解成容易消化的小分子蛋白质、肽或氨基酸，以降低牛乳蛋白的致敏性。根据蛋白水解度分为部分水解蛋白配方和深度水解蛋白配方，这2 类配方产品的食用人群为乳蛋白不耐受或乳蛋白轻度过敏和深度过敏的婴幼儿。

乳蛋白配方食品含有满足婴幼儿生长发育需要的营养物质，如脂肪、维生素、热量、碳水化合物、矿物质等，只是蛋白质通过水解等工艺变成致敏性低的小分子蛋白质、短肽或氨基酸。乳蛋白配方食品以保障营养需求为基础，降低由乳蛋白引起的婴幼儿发生过敏症状的概率。Mihatsch等[12]研究发现，水解蛋白配方乳粉可以有效提高婴幼儿的耐受性，可缩短到达全肠道的时间。

2.1 部分水解蛋白配方食品

通过生物技术将牛乳蛋白分解为小分子乳蛋白，并以此为原料生产出的乳粉称之为部分水解配方乳粉，蛋白分子质量一般为3 000～10 000 Da[13]。此配方保留了一部分抗原性，在降低乳蛋白过敏现象的同时，增强了免疫系统的耐受力，因此不仅可用于非牛乳蛋白过敏婴儿的预防，也可作为治疗婴幼儿牛乳蛋白过敏期间的饮食，作为从深度水解配方乳粉向普通配方乳粉过渡的桥梁。Bhanegaonkar等[14]研究发现，摄入部分水解蛋白配方乳粉的婴儿比摄入普通乳粉的婴儿患特应性皮炎的概率降低14%。张少冰等[15]对179 例身体检查正常但是便秘婴幼儿做了2 组喂养对照，所有婴儿均采用药物、益生菌等进行治疗，对照组喂食配方不变，实验组喂食部分水解蛋白配方乳粉，研究发现，部分水解蛋白配方乳粉对婴幼儿功能性便秘有很好的疗效。美国儿科协会提出建议：若婴儿存在高过敏的风险，且此风险来自于明显家族过敏史，建议母乳喂养或食用部分水解配方乳粉。

2.2 深度水解蛋白配方食品

通过生物技术将牛乳蛋白分解为分子质量小于3 000 Da的短肽，以此为原料生产出的乳粉称之为深度水解配方乳粉，主要用于对牛乳蛋白过敏的治疗[16]。

研究发现，以早产儿配方乳粉为营养来源的患儿和喂养深度水解配方乳粉的早产儿生长速度基本一致，证明深度水解配方乳粉可以满足对牛乳过敏的早产儿的营养需求。罗智花等[17]研究深度水解蛋白配方乳粉对早产新生儿的影响，实验组喂食深度水解蛋白配方乳粉，对照组喂食早产儿配方乳粉，结果表明，深度水解配方乳粉可以有效降低早产儿乳蛋白不耐受的发生概率。

3 现有蛋白质水解度测定方法

3.1 蛋白质水解度定义

蛋白质水解是蛋白质通过化学方法或在水解酶的催化作用下水解过程的统称，水解度代表水解过程中蛋白质中被裂解的肽键数（h，mmol/g）和总肽键数（htot，mmol/g）的比值，按下式计算。

式中：若蛋白质的性质确定，那么htot为已知常数，可从相关文献中查询。因此，蛋白质中被裂解的肽键数（h）成为确定水解度大小的关键点。

3.2 蛋白质水解度测定方法

国内外常见的测定食品中蛋白质水解度的方法有pH-stat法、三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）法、茚三酮法、甲醛滴定法和邻苯二甲醛（phthalaldehyde，OPA）法。

3.2.1 pH-stat法

蛋白质水解过程中伴随着质子的释放和吸收，此反应需要在中性或微碱性环境中进行，为了维持体系的pH值稳定，需随时加入酸或碱，根据消耗的碱或酸的量来衡量蛋白质水解程度，其原理为滴定蛋白质水解过程中释放出的质子，进而得出水解度[18-20]。国外主要采用此方法，操作简单、快捷、可重复性高。但是需要其他的方法，如OPA法来校正，且需要一套特殊的仪器设备来控制水解过程中的pH值，一般实验室无此设备。周慧江等[21]应用pH-stat法测定核桃蛋白水解物水解度，证明该法较为准确，但需要特殊仪器校正。袁斌等[22]在pH-stat法基础上建立了一种简便方法，适用于无需恒定水解液pH值的水解反应。叶健明等[23]用pH-stat法对鹰嘴豆短肽的水解度进行了测定。

3.2.2 TNBS法

Adler-Nissen[24]对TNBS法做了详细的描述，该法通过游离氨基酸与TNBS反应生成在340 nm波长处有最大吸收峰的物质。反应环境为弱碱性，当环境条件转变为酸性时反应终止。此方法测定结果相对稳定，但实验过程中需要的保温与冷却时间较长，不能实现水解度的实时监测，且实验所用试剂在实验室不常见，TNBS试剂的稳定性较差，易被苦味酸污染，导致测定空白值偏高，并且有毒，存在爆炸的危险性，必须小心操作。

3.2.3 茚三酮法

茚三酮和α-氨基酸反应生成蓝紫色物质，这种蓝紫色化合物有一定的吸光度，从而能够得到水解后溶液中游离－NH2的量，计算得出水解度。此方法简单易行，但是配制的显色剂稳定性较差，易与氧发生反应，影响测定结果，且需要较长的时间加热和冷却用于发色团的生成。不同氨基酸与水合茚三酮发生反应时的显色存在差异，导致测定结果有偏差。郭兴凤[25]对此方法做了改进，以待水解液的完全水解液作为其标准，从而解决了因不同氨基酸与水合茚三酮反应的显色差异导致的结果偏差，使结果更准确。

3.2.4 甲醛滴定法

甲醛滴定法[26]是利用甲醛与氨基酸的反应，生成羟甲基衍生物，使－NH3＋上的H＋游离出来，用滴定碱的用量确定氨基氮含量，进而计算出游离氨基酸含量。滴定量随着水解程度的增加而增加，当水解完全后，滴定值恒定。此方法简单易行，但是脯氨酸和甲醛作用有不稳定化合物产生，导致滴定体积减少，测定值偏低。而酪氨酸由于自身酚基结构会使测定结果偏高。姚玉静等[27]将此法应用于乙醇萃取牡蛎、鸡肉和南极磷虾的3 种酶解产物鲜味肽的水解度测定。徐勤等[28]对此法做了改进，测定大豆蛋白水解度，提高了测定结果准确度。

3.2.5 OPA法

在碱性条件下，蛋白质的－NH2与OPA发生反应，生成在340 nm波长条件下有最大吸收峰的异吲哚衍生物，用分光光度计可检测其光密度。OPA法快速、方便、精准，可以进行即时监测，所用仪器、试剂在实验室常见。Nielsen等[29]根据TNBS法的特点，对OPA法进行了改进，优化了不足。但是国内却很少有OPA法的相关报道。林虬等[30]在此基础上建立了OPA法，测定棉籽蛋白水解物的水解度，证明此法较甲醛滴定法和茚三酮法快捷、简便、灵敏度高、重复性好，且不会对环境产生影响。Leni等[31]应用OPA法测定昆虫蛋白的水解度。

4 结 语

对于无法以母乳为主要营养来源的婴幼儿来说，需要过早与牛乳、鸡蛋或其他营养价值丰富的食物接触，这些食物中常常含有致敏性的蛋白[32-34]，由于婴幼儿自身肠道发育不完全，发生过敏反应的概率大大增加。目前除母乳外，水解蛋白配方乳粉成为最佳选择。通过对蛋白质进行水解能有效减少过敏原独特型抗原表位的空间构象及序列，显著降低抗原性，从而降低婴幼儿对乳蛋白的过敏反应。但如果蛋白质水解过度，会导致水解产物出现苦味，严重影响产品的风味。因此，水解度不仅是衡量乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方中乳蛋白水解程度的重要质量指标，而且关系着婴幼儿食用的安全性，其研究对于监管特殊医学用途配方食品的安全、保障婴幼儿的身体健康和生命安全具有重要意义。

目前国内外开发出的水解蛋白配方食品种类越来越多，国外已经将研究低敏性配方食品作为重点，与欧美国家相比较，国内相关报道和研究较少。国家、行业、地方等方法标准体系中，均无乳蛋白水解配方食品水解度检测方法。

现有的蛋白质水解度检测方法中，pH-stat法由于步骤繁琐且需要其他方法校正，同时受到特殊仪器的制约，国内很少采用。TNBS法实验数据相对可靠，但试剂较难购买。茚三酮法由于显色剂稳定性较差，上机比色时读数不稳，很难读出准确值[34-35]，易导致测定结果偏差。甲醛滴定法简单易行，但由于试剂自身性质，导致测定结果偏低。Panasiuk[36]、徐勤[28]等的研究同样证明了茚三酮比色法及甲醛滴定法测定的水解度比OPA法的测定结果偏低许多。由于OPA法优于上述方法，更快捷、精准、不受试剂和仪器制约，可被用于建立乳蛋白水解配方食品水解度检测方法。