八角籽油成分和抗氧化性分析

刘慧勤，李秋庭*，汤星月，吴建文，范兴，廖浩，张荣林，陆顺忠

(1.广西大学 轻工与食品工程学院，南宁 530004；2.广西林业科学院，南宁 530002；3.广西职业技术学院，南宁 530226；4.广西-东盟食品安全检验检测中心，南宁 530029)

八角茴香是一种长青树八角的果实，主产于中国西南部及越南等地，具有独特的化学成分和香气，广泛应用于食品调味、中药材及香水化妆品等领域[1]。中国八角占世界的80%左右，而广西八角占中国年产量的90%以上[2]。八角果实晾晒及干燥加工过程中，籽与壳自行脱落，八角籽中油脂含量较多，而挥发性成分占很小一部分，一般被丢弃或者当作料，造成了极大的资源浪费。八角籽占八角整果干重的20%，含油率达到30%～35%，超过很多常见油料作物，且脂肪酸组成与其他常见食用植物油类似，是良好的油脂来源[3]。八角籽油同时具有独特的八角茴香气味，因此开展八角籽主要成分及八角籽油脂的研究对全面开发八角资源具有重要意义。

目前，随着对食用油的深入研究，研究者渐渐转向食用油中脂肪伴随物的研究。植物油中具有生理活性的微量伴随物主要有生育酚、多酚类物质、植物甾醇、角鲨烯等，而加工方法对油脂的产率和成分具有较大的影响。冷榨方法提油具有无溶剂残留、快速方便、充分保留油脂中热敏性物质等优点，深受消费者喜爱。工业中溶剂浸提在植物油脂提取过程中应用最为广泛。而目前关于八角籽的研究较少，且主要是对八角籽溶剂提取物的挥发性成分为主。本文主要以冷榨法和索氏抽取法来提取八角籽油，并对比其理化特性及脂肪伴随物，为八角籽油脂的开发利用奠定了一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂

八角籽：购于广西南宁高峰香料市场；37种脂肪酸标准品：购于上海安谱试剂公司；GC衍生化试剂双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(BSTFA-TMCS)(99∶1) TCI化成工业发展有限公司；胆甾烷醇(纯度>95%)、菜油甾醇(纯度>98%)、豆甾醇(纯度>95%)、δ-生育酚(纯度>95%)、角鲨烯(纯度>98%)：均购于美国Sigma公司。

1.2 实验器材

液压榨油机 德州乐陵市祥明机械厂；罗维鹏比色计、数字折光仪、8040气相色谱-质谱分析仪、UV-2700紫外可见分光光度仪 日本岛津公司；TGL-16离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；LT9/11/B180马弗炉 德国Nabertherm公司；Waters 2695高效液相色谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 八角籽成分分析

粗脂肪：参照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》；蛋白质：参照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》；灰分：参照GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》；水分：参照GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》。

1.3.2 八角籽油的制备

冷榨八角籽油(P-SAO)是将分离好的八角籽经粉碎后，利用小型液冷榨油机对其进行冷榨，过滤后于4 ℃保存。

索氏抽提油(SE-SAO)是将八角籽粉碎至30目，置于索氏抽提装置，石油醚(60～90 ℃)于85 ℃下提取，回流7 h，回收溶剂后于4 ℃下保存。

1.3.3 八角籽油理化性质分析

酸价(AV)的测定参照 GB 5009.229-2016；过氧化值(PV)的测定参照GB 5009.227-2016；采用罗维鹏比色计测量油脂的颜色，采用数字折光仪在20 ℃下测量油脂折光率。

1.3.4 八角籽油脂肪酸组成

取0.050 g油样品于10 mL离心管中，加入2 mL 0.5 mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，65 ℃皂化30 min，冷却至室温(25 ℃)。加入3 mL三氟化硼溶液，70 ℃水浴5 min，冷却至室温(25 ℃)后加入2 mL正己烷振荡3～4 min，提取脂肪酸甲酯，加入无水硫酸钠除水，以10000 r/min离心5 min。取上层液过0.45 μm滤膜，进气相色谱-质谱联用仪分析。

气相色谱条件：CD2560色谱柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)，进样口温度为250 ℃，柱流量2.28 mL/min，色谱柱初始温度为50 ℃，保持1 min，以速率20 ℃/min升温至160 ℃，再以3 ℃/min升温至205 ℃，最后以10 ℃/min升温至250 ℃，保持16 min。载气为氦气，分流比10∶1，进样量1 μL。

MS条件：离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，扫描间隔0.04 s，电压0.2 kV。

1.4 脂肪伴随物

1.4.1 总酚含量

精确称取1.000 g八角籽油于离心管中，加入2 mL 60%甲醇溶液，于摇床中以160 r/min的速度摇匀45 min后，以4000 r/min离心20 min，取0.2 mL样液于10 mL比色管中，加入1 mL福林酚溶液，混匀1 min后加入4%碳酸钠溶液至刻度，于75 ℃水浴保温20 min，冷却至室温(25 ℃)后用紫外可见分光光度仪于760 nm处测定吸光度，结果以没食子酸当量(mg GAE/g)表示。

1.4.2 磷脂含量(钼蓝比色法)

称取约10.000 g试样于坩埚中，加0.500 g氧化钙，在电炉上加热碳化后，在550～600 ℃马弗炉中灰化，加入热盐酸(1∶1，V/V)10 mL溶解灰分，并加热微沸5 min。将溶解液过滤注入100 mL容量瓶中，冷却至室温(25 ℃)后，以32%(m/V)氢氧化钾溶液中和至出现浑浊，缓慢滴加盐酸使沉淀全部溶解后，再滴2滴，最后用水稀释至刻度。吸取被测液2 mL注入25 mL比色管中，加入2.5%钼酸铵溶液2 mL、亚硫酸钠溶液(0.16 g/mL)1 mL、对苯二酚溶液(0.005 g/mL) 1 mL，然后加水稀释至刻度，加塞、摇匀，静置30 min后于650 nm处测量其吸光度。

1.4.3 甾醇及角鲨烯含量

称取0.030 g八角籽油，添加1 mg/mL，50 μL胆甾烷醇为内标，再加入3 mL 2 mol/L KOH-乙醇溶液，于90 ℃下皂化50 min后用5 mL正己烷提取2次，氮气吹干后添加100 μL BSTFA-TMCS 试剂在烘箱中进行硅烷化处理，最后采用气相色谱-质谱联用仪测定八角籽油中角鲨烯及甾醇含量。

气相色谱条件：DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度320 ℃；氦气流速0.7 mL /min。色谱柱初温为180 ℃，保持1 min，再以4 ℃/min升温至300 ℃，保持25 min。

质谱条件：传输线温度300 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃，全扫描模式，质量扫描范围50～650 m/z。

1.4.4 生育酚含量测定

称取1.000 g油样于25 mL棕色容量瓶中，加入0.1 g BHT，再加入10 mL流动相超声溶解后定容至刻度，摇匀后过0.22 μm滤膜并进Waters 2695高效液相色谱仪分析，2475 FLR检测器；色谱柱：酰胺基柱(1.7 μm×3.0 mm×150 mm)；流动相：正己烷+[叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液(20+1+0.1，V/V)]=90+10；流速0.8 mL/min；进样量10 μL；柱温30 ℃；荧光检测器波长：激发波长294 nm，发射波长328 nm。

1.5 自由基清除能力

1.5.1 极性物质的提取

称取1.0 g油脂于离心管中，添加2 mL甲醇，用涡旋仪涡旋3 min，6500 r/min离心10 min，然后取上清液到棕色瓶中，重复3次以上方法，结果以Trolox(TE mg/100 g)当量表示。

1.5.2 DPPH

取100 μL甲醇提取液，以甲醇稀释至2 mL，然后添加2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，混合后暗反应2 h，在517 nm条件下测吸光度。

1.5.3 FRAP

工作液的制备参照FRAP-2-G自由基清除能力试剂盒，在37 min条件下水浴30 min，将八角籽油甲醇提取液和上述950 μL工作液分别加入到1 mL石英比色皿中，在室温(25 ℃)下反应10 min，然后在该条件下测量吸光度。

1.5.4 ABTS

按照ABTS-2-G试剂盒说明书进行工作液制备，将25 mL含过硫酸钾的磷酸盐缓冲液与ABTS混合，混合摇匀20 min后取上清液，然后将50 μL极性提取物和950 μL工作液混合，反应10 min后，在734 nm条件下测量其吸光度。

1.6 数据统计

采用SPSS 24软件对所有数据进行独立样本T检验和标准化，结果均以平均值±标准差表示，采用Origin 2019作图。

2 结果与讨论

2.1 八角籽成分分析

本研究中八角籽脂肪酸含量为35.500%，蛋白质含量为11.430%，灰分含量为2.454%，水分含量为8.973%。八角籽含油率高，蛋白质含量丰富，因此冷榨油后的饼粕可以考虑作为饲料的一种来源。阳小勇等[4]采用索氏提取法提取不同季节的云南八角籽油，结果表明不同季节的八角籽含油率差别较大，本文研究均采用秋季的大红八角。

2.2 油样理化分析

八角籽油理化指标测定结果见表1。

表1 SAO理化指标Table 1 The physicochemical indexes of star anise seed oil

结果表明，不同方法提取的八角籽油的理化指标差异较显著，P-SAO和SE-SAO颜色有很大区别，SE-SAO呈棕黄色，P-SAO呈金黄色。油脂颜色的差异可能是油中叶绿素和类胡萝卜素含量的不同而引起的[5]。提取方式对八角籽油的折射率影响不显著。徐静的研究中得到索氏抽提八角籽油的折光率为1.463，比本研究索氏和冷榨八角籽油的折光率小，不饱和双键数量增加及温度降低均会使折光率增加[6]。P-SAO与SE-SAO酸价和过氧化值差异显著，主要原因是索氏提取过程温度较高导致甘油三脂氧化产生较多游离脂肪酸。本研究中P-SAO过氧化值高于SE-SAO，猜测可能是冷榨过程温度较低，不足以使脂氧合酶完全失去活性，导致P-SAO过滤时因暴露在空气中从而合成许多过氧化物。

2.3 脂肪酸分析

八角籽油中脂肪酸组分见表2，本研究中两种方式提取油脂中总不饱和脂肪酸含量都达到了80%左右，P-SAO与SE-SAO均以亚油酸、油酸为主要脂肪酸，含量均达到40%左右，亚油酸和油酸在环氧合酶和脂氧合酶存在下可转化为具有局部免疫调节作用但不同于激素的类花生酸。同时油酸和亚油酸也可使味觉感受细胞去极化，从而增加味觉感受的作用[7]。P-SAO和SE-SAO也都含有γ-亚麻酸，含量仅次于硬脂酸，γ-亚麻酸的代谢产物可以通过调节基因产物水平，影响免疫功能和细胞凋亡的基因表达，起到抗肿瘤和抗炎症作用[8]。八角籽油具有高度不饱和性，因此可以添加到其他食用油中，以调和脂肪酸比例，从而更满足脂肪酸的合理性。

2.4 总酚含量

总酚含量测定结果见表2，提取方式对八角籽油总酚含量影响较显著。SE-SAO总酚含量高于常见冷榨食用油如大豆油(1.480 mg GAE/100 g)、菜籽油(1.31 mg GAE/100 g)、玉米油(1.26 mg GAE/100 g)[9]，接近坚果油(0.57～2.36 mg GAE/100 g)[10]。酚类作为一种抗氧化活性物质，受到研究学者的广泛关注，在Chen等[11]的研究中，将3种酚酸与4-氨基二苯胺分子结合形成一种生物基多功能添加剂(BMAS)，添加BMAS到不同的植物油中，其抗氧化作用高于商业苯酚和芳胺。八角籽油总酚含量较高，是植物酚类物质的一个良好来源，具有较大的开发潜力。

表2 SAO脂肪酸含量Table 2 The content of fatty acids in star anise seed oil

2.5 磷脂含量

P-SAO和SE-SAO中磷脂含量见表3，两种方式提取的八角籽油中磷脂含量差异较显著。Judde[12]的研究中发现磷脂具有抑制p-茴香胺值和过氧化值的作用，使油脂氧化速度减慢。但是也有研究发现脑磷脂和糖发生反应生成一种“新的伪美拉德反应”而加深油脂的颜色，从而使油脂回色[13]。八角籽油中磷脂含量与蓖麻籽、花生油较为接近(0.200～10.000 mg/g)，高于芝麻油(1.000 mg/g)，低于大豆油(11.000～32.000 mg/g)。

表3 SAO的脂溶性成分含量Table 3 The content of fat soluble components in star anise seed oil

2.6 甾醇和角鲨烯含量分析

甾醇和角鲨烯是植物油中非常重要的脂肪伴随物。P-SAO和SE-SAO甾醇及角鲨烯含量有明显区别，见表2。两种油中检测到菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇，SE-SAO总甾醇含量高于P-SAO，两种油样甾醇的分配比基本相同，见图1。β-谷甾醇在两种油中含量最高，且含量超过总甾醇含量的60%以上，菜油甾醇含量约占30%。植物甾醇具有抑制胆固醇吸收、降低血清中低密度脂蛋白、预防冠心病等作用，是植物油中最主要的不皂物。目前暂无关于八角籽油中甾醇及角鲨烯的报道，与其他常见植物油相比，八角籽油总甾醇小于玉米油(5271.61 mg/kg)、菜籽油(5014.88 mg/kg)，高于橄榄油(489.33 mg/kg)、茶籽油(169.50～535.99 mg/kg)、大豆油(226.13 mg/kg)和花生油(1033.29～2153.19 mg/kg)[14]。角鲨烯是动物体内各种激素和植物固醇的前体，对肺癌、结肠癌和肿瘤具有预防作用。不同的提取方式对八角籽油中角鲨烯含量影响较大，其原因需要进一步探究。与常见植物油相比，P-SAO角鲨烯含量和棉籽(80 mg/kg)及茶油(120 mg/kg)接近，SE-SAO接近于菜籽油(260 mg/kg)和花生油(270 mg/kg)[15]。

P-SAO

SE-SAO

2.7 生育酚含量分析

八角籽油中生育酚含量见表3，P-SAO和SE-SAO中都只检测到了δ-生育酚。两种提取方式对八角籽油中生育酚含量影响较显著。生育酚主要存在于富含脂肪细胞的周围，如线粒体膜、油体和低密度脂蛋白胆固醇中[16]。一般植物油中生育酚存在形式为α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚3种形式，含量最多的一般为γ-生育酚。目前仅含有δ-生育酚的植物油脂鲜有报道，这应该是八角籽油所特有的。δ-生育酚通过提供氢原子与脂质氢过氧自由基结合，抑制脂质链式氧化，从而可有效阻止油脂储存过程中的氧化反应[17]。目前食品中合成抗氧化剂BHT、BHA、PG等的安全性受到质疑，具有强抗氧化作用的生育酚得到了更多人的关注。

2.8 抗氧化能力

油脂在高温度和含氧环境中容易氧化，引起油脂的氧化酸败，其色、香发生变化，从而影响食品加工和贮藏过程中的品质，因此研究油脂的抗氧化作用具有重要的意义。本文采用3种方法(DPPH、FRAP、ABTS)来表示八角籽油的自由基清除能力。3种抗氧化能力都是基于单电子转移能力，通过抗氧剂与指示剂的反应来分析抗氧剂的还原能力，并根据氧化剂的变色程度来评价抗氧剂的抗氧化能力[18-19]。结果表明极性物质的DPPH、ABTS+·强于Fe3+，且八角籽油的自由基清除能力高于普通食用油，可能与八角籽油中含有大量酚类化合物相关，此外，八角籽油和八角精油中含有相同的物质，如茴香脑、茴香醛等，这些物质在八角精油中具有较强的抗氧化能力[20]，这也可能与八角籽油强抗氧化能力相关。

3 结论

本研究中不同提取方式所得八角籽油不饱和脂肪酸含量占80%左右，总酚含量较高，八角籽油磷脂含量和常见食用油中磷脂含量接近。在两种方式提取的八角籽油中都含有菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和羊毛甾醇，β-谷甾醇占总甾醇含量的60%以上。八角籽油中仅有δ-生育酚，这可能是八角籽油特有的。索氏提取和冷榨对八角籽油的脂肪酸组成及含量影响较小，但对脂溶性成分影响较大，其中的影响机理还需要进一步研究。两种方式提取的八角籽油均具有脂肪酸不饱和程度高、总酚含量高、仅有δ-生育酚的存在形式，具有较强的抗氧化能力。索氏提取八角籽油和冷榨八角籽油相比，具有过氧化值低、总酚、总甾醇、生育酚含量高、磷脂含量低、出油率高的优点。综上，八角籽油在新型食用调味油脂开发及脂质营养方面具有较大的开发价值。